et Wils.)的单体提取物,其分子式为C19H23NO4,分子量329.38。青藤在中国应用于治疗风湿病已经有上千年历史。其目前在应用上主要以其盐酸盐形式为主即盐酸青藤碱为主。青藤碱具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、抗血管生成、抗心律失常等广泛的药理作用。新近研究报导其具有一定的抗肿瘤作用。 细胞凋亡,又称程序性死亡,包括一系列生物化学事件,引起细胞发生特征性形体变化和生物化学改变。一些药物通过诱导凋亡的方式抑制恶性肿瘤的增殖。细胞凋亡主要有三种通路：一种是以Fas和TNFR为代表死亡受体信号转导途径,凋亡发生过程中伴有caspase-8的活化；第二种是以线粒体为核心的凋亡途径,Cytochrome
c从线粒体释放到胞浆与APaf-1继而与Caspase-9结合,引起Caspase-9自身剪切激活,启动凋亡过程中伴有caspase-9的活化；第三种是以内质网为核心的凋亡途径,凋亡过程中伴有caspase-12的活化。目前青藤碱对肺癌细胞是否有抑制作用的研究尚未见报导。 本实验研究青藤碱对非小细胞肺腺癌细胞系NCIH-460增殖和凋亡的影响,并研究其机制,为深入研究青藤碱抗肿瘤机制提供实验基础,应用于临床治疗肺癌提供理论依据。 实验材料与方法 一、青藤碱对肺癌细胞系NCI-H460增殖、凋亡的影响的研究 采用四甲基偶氮噻蓝(MTT)法检测青藤碱对NCI-H460细胞增殖的；采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡；TdT酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNNEL)方法观察细胞的形态变化；采用扫描电镜观察细胞超微结构的变化。 BTK inhibitor 二、青藤碱诱导肺癌细胞系NCI-H460凋亡的机制的研究 采用罗丹明123(Rhodamine123)染色,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm)；采用分光光度法检测caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性的变化；采用Western blot方法检测SN对凋亡相关的蛋白如细胞色素C、Bcl-2、Bax的表达的影响。 三、MEK／ERK和PI3K／Akt信号通路参与青藤碱诱导NCI-H460细胞凋亡的研究 采用Western blot法检测SIN对NCI-H460细胞的ERK1／2、p-ERK1／2、Akt、p-Akt的表达的影响；采用流式细胞仪PI单染的方法检测信号通路阻滞剂与青藤碱联合对NCI-H460细胞凋亡的影响。 结果 一、青藤碱对肺癌细胞系NCI-H460增殖、凋亡的影响： 随着SIN浓度的加大和作用时间的延长,其对细胞的增殖有明显的抑制作用,呈现明显的时间-剂量效应关系。SIN 240μg／ml作用72 h,其抑制率达到最大的85.89%。流式细胞AnnexinV/PI检测细胞凋亡分析表明,SIN作用48 h,随浓度的增高,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加,与对照组相比差异具有显著性(P
近几年来,主要组织相容性复合体-I类相关链A(major histocompatibility complex class I-related chain A,MICA)抗体与实体器官移植特别是肾移植的排斥反应和移植肾长期存活率之间的关系成了移植免疫学基础和临床研究的热点。在等待肾移植的患者体内检测到了预存的MICA抗体,说明在移植前患者就接触到了MICA抗原而产生了特异性的抗体;移植后MICA抗体与免疫排斥反应和慢性移植肾失功之间均存在着密切的关系。由于MICA蛋白可以表达在血管内皮细胞表面,但不表达在T淋巴细胞,因而MICA分子可能直接引起移植肾血管的损伤,进而导致移植肾功能损害。有学者研究了MICA抗原对淋巴细胞生物学特性的影响,发现MICA抗原对T细胞和B细胞有促进其增殖的作用。最近对心脏移植的研究中发现,血清中的可溶性MICA(sMICA)分子可以减轻移植物的免疫损伤,对移植物起到保护作用。MICA分子和NKG2D是互为配受体的关系,且NKG2D是NK细胞表面的一种激活性受体。但是MICA抗原对内皮细胞的生物学特性的影响,
Fulvestrant制造商 sMICA在肾移植中的是否有保护作用,以及NK细胞能否被激活而对内皮细胞产生杀伤作用,均未见报道。 因此,本课题将分三个部分进行研究:(1)应用MICA重组蛋白对血管内皮细胞进行刺激,观察它对内皮细胞的生物学特性及其分泌功能的影响;(2)外源性抗原对内皮细胞MICA基因表达的调节作用,以及对细胞上清中sMICA的水平的影响;(3)表达MICA分子的内皮细胞与NK细胞共同培养,观察NK细胞对内皮细胞的杀伤作用,并探讨其可能的作用机制。
第一部分MICA抗原对内皮细胞生物学功能的影响 目的观察主要组织相容性复合体-I类相关链A (MICA)抗原对血管内皮细胞生物学功能的影响。 方法将外源性重组MICA蛋白分A5(5ng/ml),A10(10ng/ml),A25(25ng/ml)三个剂量加入培养基中作为实验组,A0组加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组,对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)予以培养。用流式细胞仪检测其细胞周期和凋亡情况,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,并测定各组细胞上清液中前列环素代谢产物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、内皮素(ET-1)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI)的水平。 AG14699 结果各实验组(A5,A10,A25 )内皮细胞A570值均高于对照组(A0)。以A5组增殖最为明显,A10组比A5组稍下降,两组之间差异统计学意义(P > 0.05),但明显高于A25组差异有统计学意义(P < 0.05)。在相同剂量下48h时增殖率最高,A570值分别为0.458, 0.446, 0.389。72h和96h呈持续缓慢增殖,随着时间延长增殖率逐渐下降,差异有统计学意义(P < 0.05)。A10, A25组细胞上清中的6-keto-PGF1α水平分别为144.6, 132.8pg/ml,A0, A5组分别为226.5, 232.6pg/ml;A10,A25组ET-1水平分别为23.6, 25.8pg/ml,A0,A5组分别为11.8, 10.4pg/ml。A10,A25组和A0,A5组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05);而A10与A25组比较,A0与A5组比较,差异均无统计学意义(P > 0.05)。各实验组(A5,A10,A25 ) t-PA、PAI分别为161.2, 154.2, 157.8ng/ml;221.6, 248.5, 252.4ng/ml;而对照组(A0)分别为233.5ng/ml、137.8ng/ml。实验组和对照组之间比较,差异均有统计学意义(P < 0.05);而各实验组之间比较,差异均无统计学意义(P > 0.