动物模型的建立及分组:选用健康雄性6-8周龄Wistar大鼠66只(清洁级)随机分成:对照组、模型组和乌司他丁干预组,对照组按1、

动物模型的建立及分组:选用健康雄性6-8周龄Wistar大鼠66只(清洁级)随机分成:对照组、模型组和乌司他丁干预组,对照组按1、3、6h分为3个亚组,模型组和干预组按0.5、1、3、6h分为4个亚组,共11组,每组6只。模型组大鼠给予LPS(5mg/kg)尾静脉注射,干预组大鼠在尾静脉注射LPS(5mg/kg)前30min给予UTI(50000单位/kg)尾静脉注射。对照组大鼠给予尾静脉注射等量的生理盐水(NS)。整个实验期间所有大鼠均喂标准饲料,实验前禁食12h,自由饮水。 2.标本采集:各组动物在相应的不同时点分别给予3%戊巴比妥钠腹腔麻醉打开并暴露胸腔,肉眼观察肺组织大体病理改变。经左心室穿刺抽血,离心后留取血清置于-80℃冰箱保存。取血结束后立即留取肺部标本,取左肺计算肺组织湿/干重比值(W/D);取右肺上叶以10%中性甲醛固定以备HE染色和免疫组化染色。取右肺中、下叶放入液氮中冻存,-80℃保存,以备Western

blot及Real Time RT-PCR检查。 3.常规HE染色并计算肺组织病理损伤评分。 4. ELISA法检测血清中TNF-α和IL-10的浓度。 5. Real Time RT-PCR法检测肺组织中TNF-αmRNA的相对表达量。 6.免疫组化法检测磷酸化的p38 MAPK蛋白在肺组织中的表达。 7. Western blot法检测肺组织中磷酸化的p38 MAPK的表达。 8.统计学分析:采用SPSS 13.0统计软件包分析。计量资料用means±SD表示,各组之间的差异采用单因素方差分析(one-way

Selleck OSI 744 ANOVA),其后两两之间比较采用LSD检验,p100次/分),口唇发绀,精神萎靡,少动少食,抓取时无力逃避,3h组和6h组各有1只大鼠死亡,濒死前出现抽搐,大小便失禁,深大呼吸,四肢僵硬,解剖后肉眼见肺组织体积增大,脏层胸膜张力较高,表面色泽暗红,可见包膜下点状、片状出血,切面疏松,有黄色或淡红色液体溢出,尤以6h组最为明显;干预组各时点表现相对较轻,所有动物均存活,抓取时能够逃避,解剖后肺有类似上述改变,但范围小,程度轻,体积增大不明显,表面呈红色,可见少量出血点。 selleck合成 2.肺组织湿/干重比值(W/D)的变化:模型组大鼠肺组织的W/D在3h和6h明显高于对照组(p
研究背景 多器官功能障碍综合症(MODS)是引起严重烧伤患者死亡的主要原因之一。虽然引起MODS的病理生理过程纷繁复杂,但随着研究的深入人们逐渐达成共识,血管内皮细胞的功能紊乱是这一病理生理过程的中心环节。而在严重烧伤早期,血管内皮细胞的功能紊乱主要表现为烧伤后内皮细胞“毛细血管渗漏”及随之而来的间质水肿。 危重病患者时常伴有胰岛素抵抗和高血糖,而这种“创伤后胰岛素抵抗”的严重程度往往反映了这些危重病患者(如严重创伤、严重烧伤及脓毒症)的死亡风险。在一个外科重症监护病房的前瞻性研究中,人们发现强化胰岛素治疗来严格控制血糖水平可明显减少严重感染、器官衰竭以及死亡率。在关于其机制的探讨中,一些研究人员认为代谢调节机制是强化胰岛素治疗的唯一作用途径。然而,近年来人们逐渐发现胰岛素还具有抗炎、抗凋亡、促细胞增殖以及调节机体免疫功能的特性。也就是说胰岛素除了具有代谢调节特性外还具有非代谢作用机制。近期又有研究报道强化胰岛素治疗具有内皮细胞保护作用并认为其可能是阻止危重病患者多脏器衰竭和死亡的重要机制。但到目前为止,危重病患者强化胰岛素治疗的确切机制仍不清楚。 http://www.selleck.cn/products/BafilomycinA1.html 在本课题中,我们主要是探讨胰岛素对严重烧伤后内皮细胞功能紊乱的调节作用。首先,在体严重烧伤动物模型上,利用强化胰岛素处理观察其对急性肺损伤的作用。我们的设想是强化胰岛素处理是否可以通过对微血管内皮细胞的保护,防止微血管渗漏,从而达到减轻烧伤后肺组织水肿、出血及炎性细胞浸润的目的。在此基础上,我们进一步体外利用脐静脉血管内皮细胞,观察胰岛素干预后内皮细胞单分子通透性与细胞紧密连接以及凋亡的变化和内在联系,并就可能存在的细胞内信号传导机制进行相关研究。

方法 1.雄性SD大鼠75只,随机分成假烫组、烫伤组(30% TBSAⅢ○),烫伤+胰岛素处理组。氧化酶法测定烫伤后24小时内大鼠血糖变化。烫伤12小时后,HE染色观察肺脏病理变化,检测肺脏髓过氧化物酶(MPO)、血清超氧化物歧化酶(SOD)以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量变化。同时,电镜观察肺微血管内皮细胞变化,比色法检测各型一氧化氮合酶及血清一氧化氮(NO)水平。 2.体外培养原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),随机分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组及抑制剂(LY-294002)组,利用生物素标记的BSA测定内皮细胞单分子通透性变化,罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架并观察,同时利用蛋白印迹法检测带状闭合蛋白-1(ZO-1)、咬合蛋白及磷酸化蛋白激酶B(AKT)的变化情况。 3.体外培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组,刺激6小时后运用原位末端标记(TUNEL)法观察内皮细胞凋亡,分别采用免疫组织化学染色法和(或)蛋白印迹法检测抗凋亡蛋白bcl-2及eNOS的蛋白表达情况。 4.体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)正常人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清+胰岛素(10-7mol/L)处理组及抑制剂(LY-294002)组。ELISA法检测采集血清中IL-1β和TNF-α的水平。刺激6小时后,蛋白印迹法检测HUVEC胞浆抑制酶κB-α(IκB-α)和胞核NF-κB-p65的蛋白表达变化。 结果 1.

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