MTS检测WP1066对骨髓瘤细胞的增殖抑制作用。 8.流式细胞仪检测WP1066对骨髓瘤细胞的诱导凋亡作用以及western blot及MSD检测凋亡相关基因表达变化。 结果 1. RT-PCR结果表明骨髓瘤细胞表达TLRs mRNA包括TLR 1-2,4-7和9,本课题重点研究TLR4,细胞株株MM.1S、MM.1R和ARP-1细胞表达TLR4,而U266细胞表达不明显,同时,用PE染色的TLR 4流式抗体检测了各细胞TLR4的表达情况,根据TLR 4峰的右移程度来判断表达的高低,TLR4峰右移越明显,则表明蛋白表达越高。结果发现MM.1S. MM.1R和ARP-1细胞明显表达TLR4,而U266细胞表达不明显。这个流式结果从蛋白角度表明TLR 4表达在细胞表面,而且我们还证实TLR4蛋白同时在原代骨髓瘤细胞表达。 2.TLR4的配体LPS (0、1、2、4μg/ml)刺激MM细胞后48h后,TLR4阳性表达的MM细胞株MM.1S、MM.1R和ARP-1细胞出现明显增殖,而TLR4表达阴性的MM细胞株U266增殖不明显。我们先用LPS(2μg/ml)刺激4 h,再加入阿霉素0.4μg/ml刺激24 h,最后AnnexinV /P I双染色流式检测,结果发现MM.1S和ARP-1对阿霉素诱导的凋亡有明显的抵抗作用,MM.1S细胞经LPS刺激后,阿霉素诱导的凋亡率从(79.01±15)%降至(38.73±8.5)%(P0.05],L PS不能保护阿霉素对U 266的诱导凋亡作用。而且LPS诱导细胞周期改变,LPS Alisertib (2μg/ml)处理细胞12、24和48小时后,细胞G0/G1期细胞明显减少,S期细胞明显增多。 3.TLR4的配体LPS诱导MM细胞株MM.1S和ARP-1细胞MAPK信号家族因子ERK、JNK和p38磷酸化,并增加核转录因子NF-κB蛋白表达增加,呈时间依赖,我们使用LPS作用细胞20、60和180min,结果发现LPS作用细胞20min即出现ERK和JNK磷酸化,而p38磷酸化在LPS作用细胞60min后明显,而且我们使用ERK1/2抑制剂U0126(25μM),JNK抑制剂SP600125(50μM)和p38抑制剂SB20358
(50μM)作用MM.1S细胞1小时后,LPS作用细胞48小时检测细胞增殖,我们发现LPS促进细胞增殖作用依赖MAPK信号通路。 4.使用real-time PCR方法检测了LPS对MM细胞株MM.1S细胞免疫调节分子B7-H1、B7-H2、CD40、VEGF和TGF-β的表达,结果发现LPS明显增加B7-H1和B7-H2的表达,少量增加CD40表达,TLR4活化的骨髓瘤细胞抑制健康供者外周血T细胞增殖。 5.TLR4的配体LPS (2μg/ml)作用MM细胞株MM.1R、MM.1S、ARP-1和U266细胞48小时,ELISA检测细胞上清IL-6、IL-12和IL-18分泌,结果发现LPS促进MM.1R、MM.1S和ARP-1细胞IL-18分泌,促进ARP-1细胞IL-6分泌,而对IL-12分泌无明显影响。而且我们进一步证实LPS对IL-18分泌的影响通过TLR4和MAPK途径。 6.研究发现在骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞,U266细胞STAT3持续激活,而MM.1S和ARP-1在自然情况下无STAT3激活。我们选择MM.1S和ARP-1细胞株,应用一整套细胞因子和生长因子,包括EGF 50ng/ml、bFGF 20ng/ml、G-CSF 20ng/ml、Erythropoirtin 有 10 IU/ml, IFNa-2a 50000IU/ml, IFNβ20ng/ml, IFNγ20ng/ml, IL-220ng/ml、IL-420ng/ml、IL-650ng/ml、IL-720ng/ml、IL-8 20ng/ml、IL-10 50ng/ml、IL-12 20ng/ml、IL-15 20ng/ml、IL-16
20ng/ml、IL-20 20ng/ml和IL-22 20ng/ml分别在细胞血清饥饿状态刺激30分钟,结果发现细胞因子IL-6、IFNα和IFNβ促使骨髓瘤细胞STAT3和STAT5磷酸化,而且我们还比较了血清饥饿状态和10%血清浓度下细胞对细胞因子的反应,结果发现无论在血清饥饿或血清培养状态,细胞因子IL-6、IFNα和IFNβ都能刺激STAT3和STAT5磷酸化。 7.我们检测了新颖的JAK/STAT3抑制剂WP1066对骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266的增殖抑制作用。使用WP1066浓度0.5-10μM,作用细胞24、48和72小时,MTS检测增殖抑制作用。结果发现细胞株ARP-1的IC50是24小时为3.25μM；48小时为2.74μM,72小时为1.67μM,细胞株MM.1S的IC50是24小时为3.77μM,48小时为3.20μM,72小时为2.32μM,细胞株U266的IC50是24小时为8.81μM,48小时为4.61gM,72小时为2.15μM。同时我们也检测了WP1066对骨髓瘤原代CD138+细胞的增殖抑制作用,CDl38-细胞作为对照,WP1066对骨髓瘤原代CD138+细胞有明显增殖抑制作用,24小时IC50为5.674μM,而CD138-细胞的24小时IC50大于10μM。 8. JAK/STAT3抑制剂WPl066诱导骨髓瘤细胞凋亡,凋亡相关基因caspase3和PARP裂解。我们使用WPl0661、2和5μM作用骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞24小时,AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡,并使用MSD和western blot检测裂解的caspase3和PARP,结果发现WPl066诱导细胞凋亡呈浓度依赖,而且在细胞凋亡过程中,凋亡相关基因caspase3和PARP发生裂解。 MI-773 9. JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WPl066抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,呈浓度和时间依赖。我们使用AG490浓度50、100和300μM, CABE浓度50和100μM和WPl066浓度2.5、5和10μM作用MM细胞株MM.1S和ARP-1细胞5小时,IL-6作用细胞30分钟,MSD和western blot检测磷酸化的STAT3蛋白,结果发现AG490、CABE和WPl066抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,呈浓度依赖,其明显作用浓度分别AG490为300μM, CABE为100μM和WP1066 5-10μM,而且我们还研究了药物作用的时间梯度,我们分别使用300μM AG490, 100μM CABE和5μM WP1066作用细胞1、4和6小时,检测磷酸化的STAT3蛋白,我们发现药物对STAT3蛋白磷酸化的抑制作用同样呈时间依赖,最大作用时间为6小时。 10. JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WPl066抑制IFNα诱导的STAT3磷酸化。我们使用AG490和CABE浓度50、100和300μM, WP1066浓度2.