明确GSK-3β抑制剂TDZD-8治疗能否抑制MI/R中炎性因子的产生,减轻MI/R病理损伤过程中的炎症反应,从而发挥抗炎作用。 2.如果是,进一步探讨GSK-3β抑制剂TDZD-8作用的具体信号转导机制,尤其是p38MAPK和NF-κB分子在其中的作用。
3.确定GSK-3β抑制剂TDZD-8能否下调再灌注激活的TLR2/NF-κB信号通路活性。 4.研究GSK-3β抑制剂的上述抗炎和抑制免疫效应是否最终有助于减少I/R导致的细胞凋亡和心梗范围,从而发挥显著的心脏保护作用。 实验方法 1.雄性SD大鼠,腹腔麻醉后,开胸选择性结扎冠状动脉左室支,制备心肌I/R大鼠模型。分离股动脉并插管记录动脉压,分离颈静脉建立静脉通路。缺血30 min,再灌注6 h,再灌注开始后封闭胸腔,恢复动物自主呼吸。再灌注前5min颈静脉推注不同浓度TDZD-8(0.1,1mg/kg)。I/R术中通过八道生理记录仪持续记录大鼠心电图、心率、动脉压及左室内压等血流动力学指标;分别于缺血前、缺血30 min、再灌注2h、6 h由尾静脉取血,测血糖水平;再灌注6 h后由颈动脉取血2 ml,分光光度法检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。 2.动物模型的制作同第一部分。再灌注前5min分别静脉推注二甲基亚砜(DMSO)或TDZD-8(1mg/kg)。再灌注6h后采用DAPI细胞核标记和末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法(TUNEL)复染定性和定量检测心肌细胞凋亡指数(AI)。AI以TUNEL阳性细胞数占总细胞计数的百分比表示;采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围(IS),IS以心脏梗死范围(INF)占缺血区面积(AAR)的百分比表示(INF/AAR×100%);留取心肌组织,用ELISA试剂盒检测组织TNF-α和IL-6的含量;分光光度法检测心肌髓过氧化物酶(MPO)活性;再灌注30min后采用Western BGB324 花费 Blot方法测定缺血心肌组织NF-κBp65, p38MAPK,GSK-3βSer9磷酸化蛋白含量,以检测其活性。 3.动物模型的制作同第一部分,应用实时荧光定量(RT)-PCR观察再灌注不同时间点(1h-24h)TLR2mRNA;免疫组织化学检测再灌注12h后TLR2在心脏组织中定位情况。于再灌注前5min静脉推注TDZD-8(1mg/kg),观察再灌注1h后TLR2mRNA和下游炎症因子TNF-α和IL-6mRNA变化及两者相关性;Western
Dabrafenib研究购买 Blot方法测定缺血心肌组织NF-κBp65磷酸化蛋白含量及与TLR2mRNA相关性;采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围(IS)。 实验结果 1.各组间心率在缺血期和再灌注期均不存在显著性差异,各组动脉压在缺血期间较假手术组下降(P<0.05)。CK和LDH活性反映心肌损伤程度。二者在大剂量TDZD-8组显著降低(P<0.05),增加GSK-3βSer9磷酸化(P
研究背景 WHO《世界卫生统计2008》报告:在未来的二十年,随着中低收入国家人群进入老龄化,非传染性疾病的死亡率将会大幅度增长。从全球范围看,预计到2030年,死于心血管疾病的人数将从2004年的1710万增加到2340万。 冠心病( coronary heart disease, CHD )是人类死亡的主要原因之一,每年有约380万男性和340万女性死于冠心病。发生急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后,尽早进行有效的心肌再灌注,无论是使用溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗( percutaneous coronary intervention, PCI ),还是急诊冠脉搭桥( coronary artery bypass grafting, CABG )治疗都是最有效的减小心肌梗死面积和改善临床预后的策略。然而,缺血心肌恢复血流灌注的过程中,可以诱导损伤,这种现象,称为心肌缺血再灌注损伤,可以减少心肌再灌注产生的有利影响。这种形式的损伤,可以使那些在再灌注前即刻仍然存活的心肌细胞在再灌注后很快死亡。这种形式的心肌损伤本身可以诱导心肌细胞死亡和增加心肌梗死面积,或许可以部分解释为什么尽管给予最适的心肌再灌注治疗,AMI后死亡率仍然接近10%,AMI后心力衰竭的发病率仍然接近25%。A
Cobimetinib购买 MI动物模型研究表明,最终的梗死面积,其中50%是致命的再灌注损伤引起的;这些实验模型中,许多治疗方法都显示出能够改善致命的再灌注损伤。然而,将这些能够改善再灌注损伤的实验方法运用到临床的时候,结果却令人非常失望。虽然如此,但是在2003年,赵志青教授等报告在体犬心局部缺血45 min后,再灌注开始早期给予三个循环的30 s心肌缺血/30 s心肌再灌注,可明显减小犬心肌梗死面积。并将这种心脏保护作用命名为缺血后处理( ischemic postconditioning IPost )。之后不久,Staat和Laskey分别在临床上进行PCI的AMI患者身上进行IPost,结果发现IPost能够减小心肌梗死面积达36%以及促进心肌再灌注。 虽然IPost诱导产生心脏保护作用的确切机制仍然没有完全清楚,但是发现可能是通过减轻氧化应激反应,减少细胞内Ca2 +超载,改善血管内皮功能,减少凋亡心肌细胞的死亡,减少中性粒细胞积累以及延迟中性pH的恢复。此外,发现IPost激活再灌注损伤补救激酶( reperfusion injury salvage kinase, RISK )途径,包括磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol-3-kinase, PI3-K )-蛋白激酶B ( Akt )途径和细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulating kinases, ERK )途径。最近,一些研究发现糖原合酶激酶-3β( glycogen synthase kinase-3beta, GSK-3β) Ser9磷酸化能促进心肌对缺血再灌注损伤的耐受。 IPost保护心肌缺血再灌注损伤的大多数研究都是在成年鼠类离体心脏上进行的,并发现心脏保护信号及促细胞生存机制可能涉及PI3-K/Akt, ERK1/2以及GSK-3β等。最近有一些研究发现IPost未能保护老年小鼠心脏。但是关于IPost的保护作用能否在老年大鼠或人身上获得及相关机制还是知之甚少。 研究目的 (1)确定成年大鼠在体心脏急性缺血后再灌注即刻给予缺血后处理能否保护心脏,减轻缺血再灌注损伤。 (2)评价缺血后处理能否减轻老年大鼠在体心脏缺血再灌注后的损伤,并比较后处理保护作用在成年大鼠与老年大鼠之间的区别。 (3)初步确定老年大鼠缺血后处理的保护作用是否与心肌细胞内PI3-K/Akt及GSK-3β的磷酸化有关,如果有关,则激活PI3-K/Akt和GSK-3β可能是治疗缺血再灌注损伤的新的治疗手段。 实验方法 1.