4%的诱导效率,当不添加TMP时,实验无法获得GFP+细胞,诱导效率为0；当添加的TMP浓度达到1μM时,诱导效率达到最高(约0.4%)。 在iPSCs的诱导过程中,利用TMP系统分别调控三个外源基因人源OCT4、KLF4和SOX2的表达,我们发现无论dd融合蛋白位于2A肽连接的多顺反子载体链的任何位置,都可以成功获得iPS细胞,而且可以获得相近的诱导效率(约0.4%)。进一步对三因子进行表达时间上的调控,发现在重编程过程中,早期和中期的外源OCT4和KLF4的添加不是必需的；但SOX2在这两个阶段的添加至关重要,否则将无法获得iPS细胞。 实验将dd连至人源OKSM四因子piggyBac载体的OCT4上,利用该载体可将猪的胚胎成纤维细胞系诱导成为iPS细胞。对获得的猪iPS细胞系分别进行添加和撤离TMP处理,通过TMP调控外源OCT4的表达。结果显示,TMP添加时,可维持细胞系的ES样形态并显示AP阳性,OCT4免疫荧光染色阳性；TMP撤离后,获得的细胞系呈分化状态,并显示AP阴性,OCT4免疫荧光染色阴性。表明目前获得的猪iPS细胞的多能性的维持完全依赖外源OCT4的持续表达。 对重编程过程中外源OCT4的RNA水平及蛋白水平的检测发现,两者随着诱导时间的推延,在表达趋势上并不一致,提示我们需要关注重编程过程中核心转录因子的蛋白水平情况。本课题首次将蛋白调控系统引入至诱导多能性干细胞的研究中。利用TMP系统调控核心转录因子的蛋白表达时间及剂量,有助于揭示重编程过程中各核心因子的作用机制,该系统为各物种的诱导多能性干细胞的获得及机制研究提供了更精确的蛋白水平的研究平台。
目的：在特发性肺纤维化(IPF)过程中,起主要作用的TGF-β在炎症部位活性增强,使成纤维细胞大量增殖,导致严重肺纤维化,TGF-β通过Smads蛋白的信号转导及调控发挥作用。而Smad-3是介导TGF-β诱导肺纤维化的关键分子,其通过调节靶基因而影响IL-6家族特别是IL-31的表达,进一步影响JAKs/STATs通路,从而引起肺纤维化。这是肺纤维化可能的机制。因此,本项目旨在利用体外培养细胞及BLM诱导小鼠肺纤维化模型,得到TGF-β1-Smad-3-IL-31-JAKs/STATs这条通路,研究这条通路是肺纤维化的可能作用机制,以对肺纤维化的靶向治疗提供一定的线索。
为什么 方法：将75只小鼠按随机数字表法分为3组。其中二组为博来霉素诱导肺纤维化模型组(气管内注射BLM5mg/kg0.1mL),分别为单纯造模组(BLM组,25只)、地塞米松治疗组(DXM组,25只)、每组25只；造模后1天,地塞米松组小鼠腹腔注射DXM5mg/kg1(0.1mL),每天1次,连续28天。另1组为正常对照组(NC组,25只)。给药第3、7、14、21、28天每组分别各处死5只小鼠。取肺组织行常规组织病理学观察；免疫组化检测肺组织中TGF-β1、Smad-3含量;RT-PCR法检测IL-31、STAT-1mRNA的表达量；Western selleck产品 blot测STAT-1蛋白含量；染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测Smad-2/3与IL-31启动子之间的结合联系。同时制得原代肺成纤维细胞,待培养3代后,抑制TGF-β表达,而对TGF-β表达的抑制,会下调Smad-3、IL-31的表达水平。对IL-31表达的降低,则会下调STAT-1的表达水平。同时查看肺成纤维细胞的形态,肺成纤维细胞的增殖特征,肺成纤维细胞的胶原合成；检测肺组织中羟基脯氨酸(HYP)含量。 结果： (1)对小鼠肺初步肉眼观察和对肺组织病理学的观察,可发现由于BLM的诱导作用,BLM组小鼠的肺组织根据时间先后顺序出现由3天时的轻度肺泡炎到14天时纤维化的动态改变。DXM组也呈现类似的病理改变过程,但其程度较BLM组轻,但是,对比NC组,其程度却明显加重。NC组病理变化基本未见,没有明显的肺泡炎和纤维化改变。
那个 (2) TGF-β1在NC组肺组织有弱表达,在BLM组7天-14天表达达高峰,有统计学意义(p<0.05)。DXM组也呈现类似的趋势,但比BLM组的表达明显减轻,有显著的统计学意义(P<0.01)；DXM治疗组HYP含量于14-28天有明显下降(p
运动系统的疾病,例如肌腱撕裂,肌腱炎,骨缺损等尚无理想的治疗方法,影响着人们正常工作和生活。肌腱治疗方法相对滞后,主要原因是肌腱发育分化知识的缺乏。骨发育分化知识较为明了,但再生骨组织缺乏合适的物理支架及相关理论支持。间充质干细胞属于多能性干细胞,经化学或物理因素的诱导,可向骨系、肌腱系、脂肪系和软骨系等分化,是研究细胞分化的良好平台,是组织和器官修复的理想种子细胞。因此,本课题以间充质干细胞作为主要研究对象,分别对转录因子Mkx促进间充质干细胞向肌腱系分化的作用和机制以及仿生电纺羟基磷灰石-壳聚糖纳米纤维支架的物理结构促进间充质干细胞向骨系分化的作用和机制进行了相关研究。 1.