以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH分别作用NIH3T3细胞24 h和48 h,MTT法观察不同浓度的AOH对细胞增殖的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞4 h,单细胞凝胶电泳实验观察AOH对DNA损伤程度;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞24 h,流式细胞术(FCM)检测AOH对NIH3T3细胞周期的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞48 h,将存活细胞传代后,重复刺激48 h,将细胞接种在六孔板中(150个/孔),克隆形成率实验观察AOH对NIH3T3细胞的转化作用。 2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,采用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western Blotting检测不同浓度的AOH对NIH3T3细胞中polβmRNA和蛋白水平表达的影响。 结果 1.一定浓度的AOH抑制NIH3T3细胞增殖 1.0μmol/LAOH作用24 h和48 h吸光度值与对照组相比无统计学差异(P＞0.05);2.0μmol/L以上各浓度组24

h和48 h的吸光度值均较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),显示明显的浓度依赖关系。 2.AOH损伤NIH3T3细胞DNA 计算出各组细胞的尾部DNA含量,发现1.0,2.0μmol/L AOH剂量组与对照组无明显差异,10.0,20.0,50.0μmol/L AOH组均高于对照组(P＜0.05),且50.0μmol/L组高于10.0,20.0μmol/L组,说明AOH可造成DNA损伤,且存在浓度依赖性。 3.AOH引起NIH3T3细胞周期G2/M期阻滞 1.0μmol/L和2.0μmol/L组细胞周期与对照组相比,无明显变化。随着AOH浓度的增加,G2/M期细胞百分比逐渐增大,而G0/G1期细胞百分比降低,且呈浓度依赖性,与对照相比差异均有统计学意义(P＜0.05),表明细胞被阻滞于G2/M期。 4.AOH处理的NIH3T3细胞克隆形成率提高 Selinexor 克隆形成实验结果显示,随着AOH浓度的增大,平均克隆率逐渐增高(P＜0.05),但是50.0μmol/L

AOH组克隆形成率降低了。 5.AOH诱导NIH3T3细胞中polβ表达增高 RT-PCR、免疫细胞化学和Western Blotting结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/LAOH作用NIH3T3细胞16 h后,polβ表达增高,具有浓度依赖性。 第二章AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2信号通路 ZD6474 价格 方法 1.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,检测NIH3T3细胞中PKA的活化水平;作用2 h,检测CREB的活化水平。20.0μmol/L AOH作用细胞0,30,60和120 min,检测NIH3T3细胞中PKA和CREB的活化水平。PKA特异性抑制剂H89预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/LAOH作用1 h,检测PKA活性变化;作用2 h,检测CREB的活性变化。 2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞2 h,Western Blotting方法检测细胞中p38和ATF2的磷酸化水平;20.0μmol/L AOH作用细胞0,1,2和4h,检测p38和ATF2的磷酸化水平;利用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 http://www.selleckchem.cn/products/AG-014699.html h,再加入20.0μmol/L AOH作用2 h,检测p38和ATF2磷酸化水平的变化。 3.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h后,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2 h,同时设20.0μmol/L

AOH直接作用组,Western Blotting检测AOH对NIH3T3细胞中JNK1/2的磷酸化作用和对ATF2磷酸化水平的影响。 4.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2h,Western Blotting检测细胞中磷酸化CREB表达水平的变化。 结果 1.AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号通路 1.1 AOH诱导PKA激活并发生核转位 Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对PKA的活化作用不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活PKA,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法检测结果与之一致。免疫荧光结果表明,PKA活化并转位入核。 20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,PKA的活化水平逐渐增高,在60 min时达到高峰,显示时间依赖关系。 抑制实验的Western Blotting结果显示,H89预处理组活化的PKA的表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05),免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。 1.2 AOH诱导转录因子CREB激活 Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对CREB磷酸化水平增加不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活CREB,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法、免疫荧光检测结果与之一致。 20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,CREB的磷酸化水平逐渐增高,在2 h达到高峰,显示时间依赖关系。 抑制剂H89预处理细胞后,Western Blotting的结果表明,H89部分阻断AOH诱导的CREB的活化,H89预处理组磷酸化CREB的表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05),免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。提示AOH处理细胞后,CREB的磷酸化一定程度上依赖于上游PKA的激活。 2.AOH激活NIH3T3细胞中p38MAPK-ATF2信号通路 2.1 AOH诱导p38MAPK激活 Western Blotting的结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/L的AOH均能够增加p38的磷酸化水平,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),并显示浓度依赖关系。 20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,p38的活化水平逐渐增高(P＜0.