7细胞)共培养模型进一步验证以上结论。同时,对去卵巢诱导骨质疏松大鼠给予二甲双胍干预下,检测OPG/RANKL的表达并运用骨密度、骨组织形态计量学、破骨细胞染色计数等手段来综合评价二甲双胍对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用。 结果： 1、二甲双胍对成骨细胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表达的影响 A、二甲双胍对头盖骨成骨细胞及MC3T3-E1呈浓度及时间依赖性增加OPGmRNA水平的表达。RT-PCR结果显示：与对照组相比,不同浓度二甲双胍(200-800μmol/L)分别作用于成骨细胞48h,均可呈剂量依赖性促进头盖骨成骨细胞OPG 以及 mRNA的表达(P< 0.001),800μmol/L时OPG蛋白的表达最高。为明确二甲双胍上调成骨细胞OPG的作用机制,本研究使用了各种不同抑制剂。结果示AMPK以及CaMKK特异抑制剂compound C和STO-609,而非MEK1、p38、NF-кB特异抑制剂PD9805、SB203580、Bay-117028降低二甲双胍对成骨细胞OPG上调作用。 C、二甲双胍减少成骨细胞RANKL mRNA和蛋白的表达。本研究发现二甲双胍呈剂量依赖性减少头盖骨成骨细胞RANKL mRNA水平的表达。Western
blot结果同样示二甲双胍呈剂量依赖性减少RANKL表达。 D、二甲双胍能抑制破骨细胞分化。本研究使用二甲双胍与维生素D3共同作用成骨细胞的上清液诱导Raw264.7细胞分化并进行TRAP染色计数。结果示随着二甲双胍浓度的增加,破骨细胞呈剂量依赖性减少。为明确破骨细胞的存在,本研究进一步行RT-PCR检测破骨细胞特异基因TRAP和cathepsin
K表达,结果示上述基因表达随时间的增加而增加。由此可知,二甲双胍是通过调节成骨细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞分化。 2、二甲双胍对去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响及对骨质疏松防治作用的实验研究 A、动物实验中证实,二甲双胍能上调去卵巢大鼠OPG、下调RANKL表达的影响。ELISA结果示二甲双胍能增加去卵巢大鼠血清OPG的表达；Western blot结果示二甲双胍能下调去卵巢大鼠骨髓组织中RANKL的表达。 B、二甲双胍能抑制破骨细胞形成及骨丢失。 骨密度检测：三组大鼠间股骨的骨密度均有差异(P<0.001)。OVX组低于Sham组(P<0.001),而OVX+Met组明显高于OVX组(P
矽肺(Silicosis)是由于在生产过程中长期吸入含有游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘而引起的以矽结节形成和肺间质纤维化(pulmonary interstitial fibrosis,PIF)为主的职业性肺病,以肺泡持续性损伤、成纤维细胞(fibroblast,FB)增殖及大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积而导致肺组织反复破坏、修复,最终造成肺组织中大量胶原沉积为病理特点。 Integrase抑制剂 以往研究表明,矽肺纤维化的发生、发展是复杂的多阶段过程,其中有众多细胞因子、蛋白酶系统和转录因子等的参与及相互作用,因而有可能涉及众多基因的表达活动。该过程中的基因表达十分错综复杂,单个特异基因表达的分析方法不能阐述其复杂的机制。所以,利用基因芯片将在此过程中可能存在着的相互协调的基因群体作为一个整体系统进行研究,大规模地筛选出在矽肺纤维化发生发展过程中起关键调控作用的差异表达基因,是从基因水平深入探讨矽肺纤维化发病机制的新思路。
目的 本实验以SD大鼠气管灌注SiO2粉尘制作矽肺模型,采用基因芯片技术对染尘的实验组肺组织和灌注生理盐水的对照组肺组织基因表达谱进行比较研究,在基因组范围内大规模筛选矽肺病差异表达基因,并利用多种方法对差异表达基因进行验证,以期发现重要的矽肺病相关基因,为有效地预防、治疗这一顽疾提供靶点。 方法 1.购进30只SD大鼠后,先适应性饲养一周,采用随机数字表将大鼠分为2个组,即对照组和实验组,对照组6只,实验组24只。其中实验组又分为3个时间点,分别为30d、60d和90d,每个时间点8只大鼠。 2.对实验组大鼠采用非气管暴露法染尘制作矽肺大鼠模型,对照组灌注生理盐水。经HE切片确定建模成功,Van Gieson(VG)染色看胶原纤维生成情况。 3.提取总RNA,用紫外分光光度计法检测RNA的纯度,并取总RNA样品进行甲醛变性凝胶电泳,检测总RNA完整性。 还有 4. RNA质检合格后,选择实验组大鼠60d和对照组大鼠肺组织的总RNA,选用博奥生物有限公司提供的27K Rat Genome Array共有约26962条70 mer长度的Oligo DNA,进行基因芯片杂交。 5.比较染尘的实验组和灌注生理盐水的对照组肺组织芯片结果,找出差异基因,并用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot在组织标本上进行鉴定。 6.应用凝胶图像分析系统对RT-PCR结果进行图像采集和分析,应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组织化学结果进行图像采集和分析测定,用Image J分析软件对Western Blot结果进行半定量分析处理。资料整理后,应用SPSS Statistics V17.0统计软件,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析。 结果 1.肺组织切片HE染色可见,对照组各时间点大鼠肺组织结构清晰,仅见轻微炎症反应;实验组大鼠肺组织正常结构破坏,肺组织局部病灶融合成较大的肉芽肿,其中可见较多的巨噬细胞、淋巴细胞等,形成大小不一的矽结节。肺组织切片VG染色可见,对照组大鼠各时间点及实验组大鼠30d、60d的肺组织仅见血管壁的基底膜上胶原纤维呈红色,实验组90d的矽结节内可见呈红色的胶原纤维。 2.肺组织总RNA质量检测,经紫外分光光度计测定,实验组的各时间点和对照组的大鼠肺组织总RNA OD260/OD280>1.9。甲醛变性凝胶电泳显示,各样品电泳图谱有清晰的28S、18S条带和一条浅的5S条带,且肉眼观察28S条带亮度约为18S的1.5倍。 3.