05），增加活细胞比率（P<0.05），减少细胞的坏死比率（P<0.05），同时减少KIM-1蛋白的表达量（P<0.05）。加入EPO可以减少HKC细胞在CsA作用下产生KIM-1蛋白（P
研究背景
哪里 转化生长因子-β (TGF-β)在调节心血管生理和疾病中发挥多种作用,而其中重要的作用之一就是调节血管系统中的内皮细胞功能。TGF-β信号通路的失衡会导致胚胎血管发育的异常,而且TGF-β在出生后毛细血管新生中发挥重要的作用。除此之外,研究结果提示TGF-β能调节内皮细胞的增殖,凋亡,通透性变化和形态发生。有证据表明在有心血管疾病危险因素的患者中TGF-β血浆浓度是升高的,这些危险因素包括肥胖和糖尿病。而且,研究检测到患有先兆子痫的女性循环血中TGF-β的水平是升高的。在易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E基因敲除小鼠中,TGF-β表达增加导致内皮细胞氧化应激和内皮功能紊乱。重要的是,TGF-β在内皮细胞中的生物学作用往往是矛盾的(或有保护作用或者是有害的),作用的不同取决于细胞的环境和细胞的类型。 在内皮细胞中, TGF-β发挥作用主要由活化素受体样激酶1(ALK1)和ALK5两种膜受体介导。激活的ALK1受体磷酸化Smadl/5/8,然而ALK5的激活引起Smad2/3的磷酸化。这些活化的Smad蛋白与Smad4结合,作为一个转录激活复合物调节各种各样靶基因的表达,然而ALK1和ALK5的激活可能会引起不同的内皮细胞生物学效应。除这些经典信号途径外,最近研究提示NADPH氧化酶依赖的氧化还原机制或许介导了TGF-β生物学作用的调节。特别是,TGF-β特异性上调多种细胞中Nox4型NADPH氧化酶的表达。更重要的是,这些研究证实阻断Nox4的表达或功能抑制TGF-β对多种细胞功能的影响,提示Nox4在TGF-β信号通路中发挥重要的作用。
多项证据表明TGF-β能引起不同类型内皮细胞的凋亡,然而TGF-β引起凋亡的信号机制还知之甚少。研究证实TGF-β引起肺毛细血管内皮细胞凋亡,这种作用依赖于ALK5-Smad2通路和下调抗凋亡基因Bcl-2和cFLIP。另一方面,多项研究指出p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡。然而,迄今为止鲜有研究表明TGF-β引起的内皮细胞凋亡涉及氧化还原依赖的信号途径。鉴于最近的结果显示活性氧簇(ROS)生成的增加或许在TGF-β引起的内皮细胞的凋亡中有重要作用,我们提出以下假设：Nox4依赖的氧化还原调节途径或许介导了TGF-β引起的内皮细胞的凋亡。 研究目的 1. TGF-β在内皮细胞凋亡中的作用 2.Nox4氧化还原信号通路是否介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡 很少 3.MAPK信号通路在TGF-β引起内皮细胞凋亡中的作用及机制研究 selleck化学药品 研究方法 1.人内皮细胞培养 人脐静脉内皮细胞HUVECs和永生化的人微细血管内皮细胞HMVECs购买自ATCC。细胞在含有5%胎牛血清的完全内皮细胞培养基(ECM)中培养,置于5%CO2,37℃条件的细胞培养箱中。待细胞长至融合时,用胰酶消化细胞进行传代培养,第3到6代之间的HUVECs用于实验。
2.Caspase3/7活性测定 培养在96孔板中的细胞经药物处理后,加入Caspase-Glo3/7试剂检测Caspase3/7活性。样品转移到白色96孔板中,用全波长扫描式多功能读数仪进行读板测定。 3.蛋白质免疫印迹 处理细胞后,用裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。 4. TUNEL法检测细胞凋亡 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)法按照Millipore的步骤进行,其中标记的棕褐色为凋亡细胞的细胞核,绿色为正常细胞。随机取10个视野计数TUNEL阳性的细胞和总细胞数,TUNEL阳性细胞与总细胞的比值作为细胞凋亡率。 5.ROS检测 细胞内的ROS用DCFH-DA荧光染料检测,处理后的细胞加入DCFH-DA在37。C孵育20分钟并用激光共聚焦显微镜拍照留取图片,或者将DCFH-DA孵育的细胞悬液转移到96孔白板中检测荧光强度。 6.线粒体膜电位(△ψm)的检测 荧光探针JC-1用来检测线粒体膜电位的变化。药物处理后的细胞用JC-1进行染色,然后流式细胞术或者激光共聚焦显微镜检测红绿荧光的变化。 7.Nox4干扰试验 从备选的3条Nox4shRNA中挑选出干扰效率最高的一条进行实验,携带有Nox4shRNA和对照shRNA的慢病毒载体由上海吉玛公司构建。其中靶向Nox4的shRNA序列是5′GCTGTATATTGATGGTCCTTT3′,对照shRNA序列为5′GGTGTCTTCGAATTTATGTCT3′。将慢病毒转染细胞48小时后进行后续实验。 8.实时荧光定量PCR检测mRNA水平的表达 TRIzol试剂提取处理细胞的总RNA,逆转录成cDNA,再用Taqman探针-引物体系进行PCR,18S作为管家基因检测：mRNA表达的相对变化。 9.细胞免疫荧光法 培养于Lab-Tek腔室玻片上的细胞固定后,加一抗和荧光二抗孵育,用DAPI复染细胞核,激光共聚焦显微镜拍照。 10.统计学分析 数据用均数±标准误表示,用SPSS18.