靶向Myc基因的miRNAs的预测及验证。Myc在AICAR处理后显著下调。为了探索Myc基因表达下调的原因，我们利用TargetScan和miRanda两个数据库对可能靶向Myc的miRNAs进行了预测，并筛选了其中在AICAR处理后表达上调的miRNAs进行进一步的验证。结果证实miR-34a，34b，34c能够在J1小鼠ES细胞中抑制Myc的表达，而miR-135b和miR-340也可能直接靶向Myc基因mRNA的3非编码区（untranslatedregion，UTR）调控其表达。 总之，本研究表明AICAR的加入利于J1小鼠ES细胞的自我更新和多潜能性的维持，这将为ES细胞在医学上的研究及应用提供一定的理论基础。
人参皂甙Rg3是从人参中提取的中药单体,研究表明人参皂甙Rg3具有抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等作用,Rg3抗肿瘤机理的研究是目前中草药抗肿瘤研究的热点之一。 本研究主要包括： (1)利用MTT法、流式细胞术测定人参皂甙Rg3对人食道癌EC9706细胞的生长抑制作用；采用免疫组化、RT-PCR和Westen-blot等方法分析人参皂甙Rg3对细胞周期蛋白p21、p27、c-Myc、PCNA和Cyclin-D1等表达的影响,探讨人参皂甙Rg3抑制EC9706细胞增殖的分子机制。

(2)采用A O/EB双染色和流式细胞术观察分析Rg3对EC9706细胞凋亡的影响,利用免疫组化、RT-PCR和、Vesten-blot等方法分析人参皂甙Rg3对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xL、p53、Fas和caspase-3表达的影响,探讨人参皂甙Rg3促EC9706细胞凋亡的分子机制。 (3)采用原代培养的人脐静脉内皮细胞(Human 没有 umbilical vein endothelial cells, HUVECs),利用MTT、流式细胞术、Transwel1小室、小管形成等方法观察Rg3对HUVECs的增殖、迁移、侵袭等方法,研究人参皂苷Rg3体外的抗血管生成作用。 (4)利用免疫细胞化学、RT-PCR、Western-blot等方法,对人参皂甙Rg3作用后EC9706食道癌细胞中血管生成相关分子MMP-2、MMP-9和VEGF的表达进行研究,探讨Rg3对食道癌新生血管抑制的作用机制。 结果显示： (1)50μmol/L人参皂甙Rg3即能抑制食管癌细胞EC9706的增殖,并且有时间和剂量依赖性,人参皂甙Rg3作用后EC9706细胞中G0/G1期细胞数目依浓度递增逐渐增加,而S期和G2/M期细胞数目则依浓度增加而逐渐减少。Rg3作用后,Cyclin-D1和PCNA表达水平皆降低,p21和p27蛋白水平增高,p21蛋白的增高更明显。

(2)200μmol/L、100μimol/L、50μmol/L的Rg3对EC9706细胞凋亡的结果显示,作用48h后EC9706细胞凋亡百分数分别为35.19%,15.48%,8.16%,与对照组相比均有显著性差异,(P
天然免疫系统通过模式识别受体,包括Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)和DNA受体等,识别入侵机体的病原微生物模式相关分子(pathogen-associated NU7441分子重量 molecular pattern, PAMP),经过一系列信号转导,进而启动天然免疫反应。识别PAMP后,这些受体进而活化共同的下游通路激活转录因子包括转录因子NF-κB和IRFs (interferon 确认细节 regulatory factors),进而产生炎性细胞因子以及I型干扰素,进而诱导随后的适应性免疫应答。I型干扰素与其受体相互作用,活化JAK (Janus kinase)和STAT (Signal transducers

and activators of transcription)信号通路,诱导IFN-stimulated genes (ISGs)的表达,这些ISGs协同作用,激活机体的抗病毒反应。尽管,I型干扰素在机体的清除病毒反应中起着非常重要的作用,但是异常的I型干扰素的产生,会引发各种相关免疫疾病。因此,严格的调控I型干扰素对于维持机体的免疫稳态是非常重要的。 去泛素化酶(DUBs)能够从靶蛋白上切除泛素分子或者泛素样分子。已有研究表明,一些DUBs参与调控I型干扰素通路。类如A20、DUBA、泛素特异性蛋白酶17(USP17)、USP4以及USP3等分子通过不同的作用机制调控I型干扰素通路。USP2属于泛素特异性蛋白酶家族,由于剪接方式不同,产生3个剪接体USP2a、USP2b和USP2c。有研究表明USP2a通过靶向TRAF6负向调控IL-1β和病毒诱导的NF-κB活化,然而USP2在I型干扰素通路以及机体抗病毒反应中的作用仍然未知。 因此,本研究从以下几个方面进行。 研究目的： 1.USP2是否参与调控I型干扰素通路,那个剪接体会发挥作用。 2.探讨USP2调控I型干扰素通路的作用机制。 3.USP2是否参与调控其他的天然免疫信号通路。 研究方法： 1.病毒SeV诱导的I型干扰素通路中,USP2表达情况 SeV感染HEK293或THP1细胞不同时间点,Western blot检测USP2蛋白表达。 2.USP2调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达 2.1报告基因方法检测USP2对IFN-β报告基因活化的影响 HEK293细胞转染不同梯度USP2a、USP2b和USP2c表达质粒以及IFN-β-luc报告基因质粒20h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 HEK293细胞转染USP2干扰RNA以及IFN-β-luc报告基因质粒48h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 2.2PCR扩增检测USP2对IFN-β基因表达的调控 HEK293细胞转染USP2a、USP2b和USP2c表达质粒20h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。 HEK293或THP1细胞转染USP2干扰RNA48h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。 3.USP2调控I型干扰素通路的作用机制 3.1确定USP2作用的靶分子 将RLRs信号通路中的接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒共转染到HEK293细胞中,24h后,PCR检测IFN-β基因表达。 HEK293细胞转染接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒和IFN-β-luc报告基因质粒24h后,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 3.