雌激素影响LPS诱导的大鼠BMSCs表达OPG/RANKL的炎性因子调控途径
加入LPS、E2，并分别加入TNF中和性抗体anti-TNF-α，antiIL-1β，以及IL-6可溶性受体sIL-6R。分别培养6h、12h、24h、48h和72h后，收集细胞培养上清液进行OPG和RANKL的ELISA检测。 结果显示，加入antiTNF-α、antiIL-1β和sIL-6R后，OPG表达与单纯加入E2无明显差别，与加入LPS和E2比较略有下降，至24h达高峰，随后逐渐下降；RANKL的表达与单纯加入LPS相比，以及与加入LPS和E2相比，均有不同程度的下降，其中以加入sIL-6R后最为明显，至24h表达水平达到最高峰。 结论： 1.通过大鼠全骨髓贴壁筛选法可以对BMSCs进行分离、纯化、培养和扩增，将其生物学特性和流式细胞术检测表型特征相结合，可以鉴定为大鼠BMSCs。 2.LPS可以诱导BMSCs分泌表达炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6，雌激素可以显著抑制炎性因子的高表达，并且呈浓度依赖性，表明雌激素具有明显的抗炎作用。 3.LPS和雌激素共同刺激下的BMSCs炎性因子表达量6h时处于上升期，12h和24h处于高峰，48h和72h时表达下降，表现为明显的时间依赖性。 4.MAPK信号通路可能是雌激素调控BMSCs炎性因子表达的途径之一。 5.雌激素可以明显促进BMSCs中OPG的表达，LPS可以明显促进BMSCs中RANKL的表达，雌激素可以通过调控OPG/RANKL的比值提高LPS作用后BMSCs的骨向分化能力，促进炎症微环境下BMSCs的骨向分化。 通常 6.经LPS与E2作用后，大鼠BMSCs的OPG表达在6h开始上升，12h到24小时到达高峰，随后下降，而RANKL的表达在6h上升，12h以后一直保持较高水平。 7.雌激素可以通过调控炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达的途径对LPS诱导的BMSCs表达OPG/RANKL进行调控，雌激素调控炎性因子的表达是其发挥生物学功能的途径之一。
肺纤维化是严重危害健康的呼吸系统常见并发症,是各种不同病因的肺间质疾病的最后共同结局。由于大部分肺部疾病的最终转归都伴有不同程度的肺纤维化,因此肺纤维化不仅是肺部疾病转归的结果,还是导致原有疾病进一步恶化的主要原因。目前肺纤维化的临床治疗以给予皮质类固醇类和其他免疫抑制剂药物为主,但是研究发现其只对部分肺纤维化患者有效,对特发性肺纤维化患者疗效较差。肺纤维化的发病率和死亡率近年呈逐渐上升态势,对人类健康危害极大。因此,寻找新的治疗策略迫在眉睫。 Antiflammin-1(AF-1)是与子宫珠蛋白(uteroglobin, UG)第三个alpha螺旋中的保守序列高度同源的一段寡肽,由于最初发现在体内具有较强的抗炎作用而得名。AF-1由九肽组成,对应于UG分子中的第39～47位氨基酸(MQMKKVLDS)。研究证实,AF-1具有抗炎、抑制细胞趋化及粘附等多种与UG相似的生物活性。与大分子天然蛋白UG相比较,
Selleckchem ISRIB AF-1的分子量更小,免疫原性更低,因此具有潜在的应用前景。以往的研究集中在对AF-1的抗炎作用和机制的探索上,鉴于UG在肺纤维化发生发展中的重要作用和本课题组前期关于AF-1抑制转化生长因子betal (transforming growth factor-betal,TGF-β1)诱导的NIH3T3增殖的作用,本课题首先在整体实验部分探索AF-1是否具有抑制博来霉素(bleomycin, BLM)诱导的小鼠急性肺炎症反应和抗肺纤维化的作用。 我们在前期实验中发现,UG的活性片段AF-1也能够特异性地结合UG受体,并且通过UG受体的介导,AF-1能够特异性的调节小鼠成纤维细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated
protein kinase, MAPK)信号途径。由于UG受体同样表达于肺泡上皮细胞上,那么,既然AF-1能够通过结合成纤维细胞膜上的UG受体而抑制TGF-β1促增殖的作用。那么是否AF-1同样能通过上皮细胞膜上的UG受体而发挥某种生物学功能?本课题进一步在细胞实验部分尝试观察：①AF-11是否能够抑制TGF-β1诱导的上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal 那个 transition, EMT)的作用?②如果能,是否同样依赖于UG受体的介导? 第一章AF-1抑制博来霉素诱导的急性肺损伤 方法： 将60只实验小鼠随机分为3组,A组为生理盐水组,B组为BLM组,C组为BLM+AF-1组。单次给予小鼠气管内注射BLM(5mg/kg)以造成小鼠急性肺损伤,每日腹腔注射AF-1(2mg/kg),于BLM给药7天后收集样本,检测肺湿干重比值,HE染色法观察小鼠肺组织病理形态学变化,ELISA法检测肺组织匀浆TGF-β1、白介素-1beta(interleukin-1β, IL-1β)及肿瘤坏死因子-alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的浓度,肺组织匀浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的检测,肺泡灌洗液中细胞分类计数、蛋白含量及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性的检测。 结果：(1)气管内注射BLM(5mg/kg)后第7天,BLM组肺湿干重比值、肺系数及MPO活性较正常对照组显著增加(P<0.05),经AF-1处理后,肺泡灌洗液中LDH活性和蛋白含量较BLM组明显下降(P<0.05)。经AF-1处理后,肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞的数量和百分比、淋巴细胞的数量较单独给予BLM组明显下降(P<0.05),经AF-1处理后,小鼠肺组织中TGF-β1、IL-1β、TNF-α的水平的显著下降,与单独给予BLM组相比,差异具有统计学意义(P<0.