骨髓移植实验证明免疫细胞在PDCD4缺失导致动脉粥样硬化减弱过程中发挥主要作用 (1)分别收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠股骨和胫骨中骨髓细胞,通过尾静脉注射移植入受致死剂量X射线照射的Ldlr-/-小鼠体内,高脂喂养12周和16周后,分别处死小鼠,主动脉根部制备冰冻切片,HE和油红O染色观察并比较斑块的大小。 (2)冰冻切片进行免疫组化染色比较巨噬细胞和T细胞在斑块局部的浸润情况。 (3) Western blot的方法检测骨髓移植后高脂喂养2周、12周和16周的Ldlr-/-小鼠血管斑块中PDCD4的表达。
2.体内实验研究PDCD4缺失对巨噬细胞和T细胞亚群的影响 (1)Pdcd4-/-Apoe-/小鼠和Apoe-/-小鼠高脂喂养8周或16周后,研磨小鼠脾脏,制备脾细胞的单细胞悬液,用流式细胞术的方法检测并比较巨噬细胞和T细胞各亚群(CD4+,CD8+,Th17,Treg)比例的变化,并用直线回归的方法分析其比例与斑块面积大小的相关性。 (2)冰冻切片免疫荧光或免疫组化染色比较斑块局部CD4+和CD8+比例的变化。 3.体内实验研究PDCD4缺失对巨噬细胞和T细胞相关细胞因子的影响 (1)血清中：流式细胞微球芯片试剂盒和ELISA的方法检测并比较Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠高脂喂养后血清中细胞因子(IL-2,IL-4,IL-6,IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-p)的改变,并用直线回归的方法分析细胞因子浓度与斑块面积大小之间的相关性。 Z-VAD-FMK核磁共振 (2)斑块局部： 1)冰冻切片免疫双荧光染色比较斑块局部IL-17和IL-10水平的变化。 2)将含有大量斑块的主动脉弓及胸腹主动脉血管组织裂解提取RNA或蛋白,分别用real time PCR或Western
blot的方法检测并比较斑块局部细胞因子的改变。 4.体外实验研究PDCD4对T细胞功能的影响及其机制 (1)对T细胞增殖能力的影响： 1)体外培养脾细胞并刺激活化,CCK8试剂盒检测并比较实验组与对照组的增殖情况。 2)流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞的增殖情况。 3)流式细胞仪分别检测CD4+和CD8+T细胞中协同刺激分子CD28、CD137和协同抑制分子CTLA-4比例的变化。 (2)对T细胞分泌细胞因子的影响：流式细胞微球芯片试剂盒检测并比较培养上 selleck怎么样
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selleck中国 清中细胞因子的改变。 5.体外实验研究PDCD4对巨噬细胞功能的影响：收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞进行体外培养,并用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激不同的时间段使其活化,ELISA的方法检测并比较培养上清中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和抑炎性细胞因子IL-10的浓度。 6.体内干预治疗确定IL-17和IL-10在PDCD4缺失减弱动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用：以Apoe-/-小鼠做正常对照,将Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分为三组,高脂喂养4周后分别给予生理盐水、重组IL-17细胞因子和IL-10中和性抗体腹腔注射一周一次,共注射5周,处死小鼠,主动脉根部制备冰冻切片,HE和油红O染色观察并比较斑块的大小。 7.分子机制研究探讨PDCD4从翻译水平还是转录水平调控IL-10的表达 (1)RNA蛋白结合免疫沉淀试剂盒(RIP)获得与PDCD4结合的全部RNA, real time PCR扩增IL-10,确定PDCD4是否与IL-10mRNA形成复合体从而确定PDCD4是否从翻译水平调控IL-10的表达。 (2)提取活化巨噬细胞的总RNA,用RT-PCR的方法检测并比较IL-10在mRNA水平的表达。 (3)提取活化巨噬细胞的蛋白,用Western
blot的方法检测并比较MAPK (JNK,ERK1/2,P38)信号通路的活化情况,并通过加入信号通路抑制剂后ELISA检测上清中IL-10的表达情况确定PDCD4通过哪条信号传导通路调控IL-10的转录。 结果 一、PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达与作用 1.动脉粥样硬化小鼠模型的建立我们给予8周龄的Apoe-/-小鼠高脂饲料喂养,造成体内高血脂坏境,诱导斑块的形成。分别取8周龄(未高脂)做为无斑块期,16周龄(高脂8周)做为早期斑块期和24周龄(高脂16周)做为晚期斑块期。 2. PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达 或者 为了明确PDCD4在动脉粥样硬化发展过程中的表达情况,我们分离16周和24周Apoe-/-小鼠富含斑块的主动脉弓及胸腹主动脉裂解蛋白,以8周龄无斑块血管为对照,western blot的方法检测了PDCD4的表达情况,结果显示随着高脂喂养时间的延长(即动脉粥样硬化斑块的发展)PDCD4的表达明显升高。免疫组化染色发现PDCD4主要表达于免疫细胞(巨噬细胞和T细胞),另外,在平滑肌细胞中也有表达,提示PDCD4可能具有促进动脉粥样硬化斑块形成和发展的作用。 3. PDCD4在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用 为了研究PDCD4在动脉粥样硬化形成过程中的作用,我们制备了Pdcd4和Aope双基因敲除(Pdcd4-/-Apoe-/-)小鼠,并以此小鼠为实验组,以Apoe-/-小鼠为对照组,研究了PDCD4缺失对动脉粥样硬化形成的影响。结果发现高脂喂养8周或16周后Pdcd4-/-Apoe-/小鼠主动脉根部的斑块和主动脉弓及胸腹主动脉段的斑块较对照组相比,面积均明显减小(p<0.01),脂质沉积减少(p<0.01),局部巨噬细胞和T细胞的浸润都较对照组明显减少(p<0.05)。另外,胶原含量、平滑肌细胞也明显减少(p<0.01),CD4+T细胞比例呈降低趋势,其中CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例明显上升(p<0.01),而TregCFoxp3+)细胞数量占斑块面积的比例则比对照组明显升高(p<0.05),而IL-17和TGF-β浓度较对照组降低(p<0.05),而IL-10明显高于对照组(p<0.05),而TGF-β较对照组升高(p<0.05)；提供抑制信号的CTLA-4在CD4+和CD8+T细胞上的表达均较对照组升高(p
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病,在65岁以上人群中PD的患病率为1%-3%,其临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势不稳。PD由英国医师James B.