5HZ,8h/d,3d）条件下Ihh对软骨细胞肥大分化的影响。 方法 （1）培育Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl和Ihhfl/fl基因工程小鼠，并鉴定其基因型。（2）提取未成熟小鼠肋软骨细胞体外培养，并鉴定其表型。（3）取P1代未成熟小鼠肋软骨细胞，随机分为对照组和CTS组，CTS组加载CTS，通过RT-PCR和ELISA检测Ⅱ型胶原（Collagen GDC-0449订单 type Ⅱ，Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（aggrecan，AGG）糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAG）、X型胶原（Collagen type X，Col-X）和基质金属蛋白酶-13（Matrix metalloproteinase13，MMP-13），以观察CTS对软骨细胞肥大分化的影响。（4）对Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠进行Ihh基因敲除,取其P0代肋软骨细胞为敲除组;而Ihhfl/fl基因工程小鼠不能敲除Ihh基因为对照组，通过RT-PCR检测Ihh和Gil-1,观察Ihh基因敲除率。（5）对注射TM的Ihhfl/fl和Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl小鼠的P1代肋软骨细胞施加CTS,分为CTS组（Ihhfl/fl）和CTS+敲除组（Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl），RT-PCR检测Ihh、Gil-1、Col-Ⅱ、AGG、Col-X和MMP-13mRNA的相对表达量，ELISA检测Col-Ⅱ、GAG、Col-X和MMP-13的蛋白表达量，以观察CTS条件性下Ihh对软骨细胞肥大分化的影响。
结果 （1）从P0代到P2代，随着传代次数的增加，AGG和COL-Ⅱ mRNA的相对表达量逐渐下降，而COL-ⅠmRNA的相对表达量逐渐升高。（2）RT-PCR和ELISA检测：CTS组Col-Ⅱ和AGG（GAG）的表达低于对照组，Col-X和MMP-13的表达高于对照组。（3）敲除组Ihh和Gil-1mRNA相对表达量低于对照组,Ihh基因敲除率为64%。（4）RT-PCR检测：CTS+敲除组Ihh和Gil-1mRNA相对表达量低于CTS组，Col-Ⅱ和AGG mRNA相对表达量高于对照组，Col-X和MMP-13mRNA的相对表达量低于CTS组；ELISA检测：CTS+敲除组Col-Ⅱ和GAG的蛋白表达量高于对照组，Col-X和MMP-13的蛋白表达量低于CTS组。 结论 （1）体外单层培养未成熟小鼠肋软骨细胞，反复传代会导致其发生去分化。P1代软骨细胞能够保持其大部分分化表型。（2）CTS（sin10%,0.5HZ,8h/d,3d）促进软骨细胞肥大分化。（3）以P1代未成熟小鼠肋软骨细胞作为软骨细胞来源，用条件性敲除Ihh基因的方法研究发现，在CTS（sin10%,0.5HZ,8h/d,3d）条件下Ihh促进软骨细胞肥大分化。
目的：Notch信号通路主要影响细胞的生长、增殖和分化，其异常激活常常与肿瘤的发生相关，但是有关Notch诱导肿瘤发生的分子病理机制还不完全清楚。本课题以液体肿瘤急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）和实体肿瘤胰腺导管癌（PDA）为研究对象，通过细胞生物学和分子生物学等研究方法，研究Notch直接调控靶基因的分子机制，考察Notch阻断剂抑制癌细胞增殖的活性。这项工作不但有助于深入了解Notch诱导肿瘤发生的分子机制，而且有望为新型肿瘤分子靶向治疗提供新思路。
Microbiology抑制剂 方法：鉴定Notch信号通路在T-ALL中的新型靶基因：用γ分泌酶抑制剂GSI或负显性DNMAML1封闭小鼠T-ALL细胞中的Notch信号通路，然后分别检测新靶点重组激活基因（Rag1和Rag2）mRNA的表达水平和蛋白质的表达水平。随后利用染色体免疫共沉淀测序技术（ChIP）鉴定Notch是否能直接结合Rag1或Rag2基因表达调控区。 Notch信号通路影响胰腺导管癌细胞生长增殖的功能和机制研究：用MTT法测定GSI对胰腺癌细胞增殖的抑制作用；然后用同样方法测定GSI是否协同化疗药物吉西他滨对不同恶性程度的胰腺癌细胞增殖的抑制作用。最后的机制研究亦采用实时荧光定量PCR技术检测靶基因c-Myc、Hes1、Jagged1和Jagged2的mRNA含量。 结果：鉴定Notch信号通路在T-ALL中的新型靶基因：实时荧光定量PCR和Western Blot的结果显示，GSI处理的小鼠T-ALL细胞G4A2和T6E中Rag1和Rag2mRNA的表达水平和Rag1蛋白质的水平都发生了显著下调；DNMAML1转染的T6E细胞中，Rag1和Rag2mRNA的表达水平明显下降。染色体免疫共沉淀的结果显示进入细胞核内的Notch能与Rag2基因上游的转录调控区结合。 Notch信号通路影响PDA细胞生长增殖的功能和机制研究：MTT法检测显示， 很少 GSI能抑制多种胰腺导管癌细胞的增殖，但程度不显著；当GSI和传统化疗药物吉西他滨联合用药时，癌细胞的数量明显减少。实时荧光定量PCR的结果显示Notch信号通路下游基因c-Myc、Hes1、Jagged1和Jagged2mRNA的表达水平都有了不同程度的下降，在不同恶性程度的PDA细胞中靶基因受调控的程度不同；其中Hes1mRNA的表达水平在各种PDA细胞中都有较大程度的下降，而c-Myc在恶性程度较高的癌细胞中下调明显。 结论：在急性T淋巴细胞白血病细胞中，我们发现并验证了两个Notch信号通路能直接调控的靶基因Rag1和Rag2。在胰腺导管癌细胞实验中，GSI抑制胰腺癌细胞增殖的作用不显著，与吉西他滨协同用药后能抑制恶性程度较高的PDA细胞的增殖。Hes1在各种PDA细胞中都有较大程度的下降，c-Myc仅在恶性程度较高的肿瘤细胞中下调较明显，提示它们为Notch下游介导重要功能的靶基因。
目的：探讨Hedgehog信号通路在肝癌细胞HepG2.2.15增殖、迁移中的作用。 方法：培养肝癌细胞HepG2.2.15，用5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L环耙明处理HepG2.2.