体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 Alisertib临床试验 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,10μM)；2.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；置细胞培养箱孵育。
2.基因转染 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞实验各组细胞。转染48h后,将培养基更换为不含血清的DMEM培养基,并进行后续实验。 3.细胞存活率的检测 使用MTT方法检测小胶质细胞存活率。4.细胞凋亡检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。5. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt和cleaved caspase-3等蛋白水平变化。 结果 1.吗啡处理引起小胶质细胞P-arrestin 2蛋白水平降低 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平明显降低,而P-arrestin 1蛋白水平无明显变化。纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡引起的小胶质细胞凋亡 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。MTT检测细胞存活率,发现高表达P-arrestin 2可减少吗啡处理引起的细胞存活率下降。而RNA干扰减少β-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞存活率下降。采用TUNEL方法检测细胞凋亡,发现高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的细胞凋亡。而RNA干扰减少P-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞凋亡。Western Blot结果显示高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的caspase-3激活,而RNA干扰减少β-arrestin Selleck AZD2281 2水平,可增加吗啡处理引起的caspase-3激活。 3.β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用 将携带β-arrestin2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。Western
Blot结果显示,高表达P-arrestin 2可缓解吗啡引起的phosphor-Akt水平降低,而通过RNA干扰降低P-arrestin 2水平,可增加吗啡引起的phosphor-Akt降低。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径引起小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平降低。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡处理引起的小胶质细胞凋亡。 3.高表达β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用。
目的：1.观察在脂多糖激活原代培养大鼠小胶质细胞模型中,TNFα和HMGB1蛋白表达及TNFαmRNA和HMGB1mRNA表达的时间依赖性。2.观察NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)和p38MAPK抑制剂SB 203580对体外TNFα诱导的原代培养大鼠小胶质细胞HMGB1蛋白表达及mRNA的影响。3.观察鞘内注射Etanercept对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)大鼠痛阈和脊髓小胶质细胞活性、NF-κBp-p65、p-p38MAPK、HMGB1表达的调节,并探讨其临床疼痛治疗的机制。
方法：1.用脂多糖(100ng/ml)刺激原代培养大鼠小胶质细胞,根据不同的指标设定取样时间点(Oh,2h,4h,6h,8h,12h,16h,18h,24h),用ELISA法检测相应时间点细胞培养上清中TNFα和]HMGB1表达情况,用Western Blot检测细胞裂解液HMGB1表达情况,用RT-PCR检测TNFαmRNA和HMGB1 mRNA的表达。2.采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立两部分,分别用PDTC和SB http://www.selleck.cn/products/mi-773-sar405838.html 203580处理。第一部分设立对照组、TNFα(25ng/m1)组、TNFa+PDTC组、PDTC组,第二部分设立对照组、TNFα组、TNFα+ SB 203580组、SB 203580组,均孵育16h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1表达情况、Western blot检测细胞HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测HMGB1 mRNA表达。3.252只成年雄性SD大鼠,体质量250～300g,鞘内置管成功后,随机分为7组(n=36)：正常对照组：实验大鼠不做任何处置；假手术组：仅暴露左侧坐骨神经不结扎；假手术+Etanercept组：假手术处理大鼠并经鞘内置管注入Etanercept组；CCI组：大鼠CCI手术处理；CCI+Etanercept组。鞘内置管3d后按每组处理不同,开始鞘内输注生理盐水和Etanercept,每2d鞘内给药一次,鞘内注射2d后分别建立大鼠CCI神经病理性疼痛模型和假手术模型,测定大鼠的痛敏值,并在CCI后第3,7,13天处死大鼠,取脊髓腰膨大部进行免疫组化测定OX42表达、用Western Blot检测HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测(?)HMGB1 mRNA表达。 结果：1.LPS刺激后大鼠小胶质细胞形态呈巨噬细胞样变化;TNFα的分泌于8h达峰值,细胞内及细胞外HMGB1的分泌分别于18h和24h达峰值,TNFαmRNA的表达于2h即达峰值,HMGB1mRNA自8h开始增加,12h达峰值。2.TNFα刺激后大鼠小胶质细胞裂解液及上清液中均有HMGB1蛋白表达增高,PDTC可抑制TNFα诱导的NF-κBp-p65核表达,并下调HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的表达；SB 203580可抑制TNFα诱导的p-p38MAPK表达(P<0.01),同样下调HMGB1蛋白和HMGB1mRN的表达。3.CCI组与Sham组比较大鼠术后各时点痛敏阈值明显下降,并在术后第3d降至最低点(P<0.01),脊髓OX42、p-p65、p-p38MAPK的表达明显升高(P<0.