05),在冠状血管ADM阳性表达面积和平均光密度明显明显低于3dEP组和C组(p<0.05)。(7)3dEP组心肌ADM含量与C组相比,差异不具有显著性;3wEP组心肌ADM含量明显高于C组(p
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿瘤。资料表明,目前我国乳腺癌发病率正以每年2%-3%的速度递增,10年间我国主要城市的乳腺癌发病率增长了37%。特别是在30-54岁年龄组中,乳腺癌已成为威胁女性健康的“头号杀手”。受体三阴性乳腺癌(triple-negative
www.selleckchem.cn/products/MLN8237.html breast cancer, TNBC)是近些年学者提出的一个新的乳腺癌亚型,是指肿瘤细胞膜表面缺乏雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的一类乳腺癌。TNBC的发病率占乳腺癌总发病率的11%-20%,尤其好发于年轻女性,且该类乳腺癌具有术后易复发、易远处转移和预后差的特点,对内分泌治疗和针对HER-2的靶向治疗无效,至今仍缺乏令人满意的综合治疗方案。 近年来,非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)在抑制肿瘤活性方面展示了很好的应用前景,大量体内外研究显示,常规服用NSAIDs可以大幅度降低乳腺癌等多种肿瘤的发病风险,因此,该类药物引起了广大学者的关注。Harris等研究发现,新一代特异性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂celecoxib,不仅能明显延迟肿瘤的发生,还可以降低乳腺癌的发病率及肿瘤体积。目前,有学者研究认为,celecoxib的抗肿瘤作用机制可能与降低肿瘤组织COX-2表达、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡有关。但也有学者认为celecoxib的抗肿瘤作用机制并不是依赖抑制COX-2途径,其具体作用机制目前尚存在争议。 Kim和Subhashini等研究报道,celecoxib可通过NF-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)途径抑制宫颈癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡。而NF-κB活性失控与肿瘤的形成密切相关,且TNBC中NF-κB异常活化,因此我们想阐明在TNBC中celecoxib是否主要通过下调异常活化的NF-κB而发挥作用。 NF-κB是1986年发现的,从成熟的B淋巴细胞中抽提出的能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的核因子。抑制NF-κB活性可以抑制肿瘤细胞增长、促进细胞凋亡、增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、抑制炎症反应、减少肿瘤血管生成等。作为NF-κB主要发挥转录调节功能的亚基p65,在肿瘤的发生、发展中发挥着关键性作用,下调p65的表达可以抑制多种肿瘤细胞在体内外的增殖及诱导细胞凋亡。因此,p65的靶向治疗可能在乳腺癌的临床治疗中拥有广泛的应用前景。 Protein Tyrosine激酶抑制剂 目的:本实验中选取三阴性高侵袭性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为研究对象,通过不同的实验方法探讨celecoxib的抑癌作用,研究celecoxib在三阴性乳腺癌细胞中对NF-κB活性的影响;检测异常活化的NF-κB信号通路在MDA-MB-231细胞增殖、凋亡以及侵袭中发挥的作用;评价celecoxib是否能够成为TNBC个体化治疗的辅助用药,针对NF-κB信号通路的靶向治疗能否使乳腺癌的化学治疗更加完善,最终为预防、治疗TNBC提供新的治疗思路。
方法: 1以不同浓度的celecoxib作用人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,MTT比色法观察其对该细胞增殖的影响,并进一步探讨celecoxib抑制MDA-MB-231细胞的增殖与COX-2途径依赖关系。采用流式细胞仪技术(flow cytometry, FCM)、Hoechst 33258、DNA Ladder形成实验、western blot等方法,研究celecoxib对体外培养的MDA-MB-231细胞凋亡的影响。 2采用伤口愈合实验、transwell侵袭小室实验等,观察celecoxib对MDA-MB-231细胞侵袭行为的影响。并通过RT-PCR法检测肿瘤细胞侵袭转移关键的细胞因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)及IL-8(interleukin-8, IL-8)的表达变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-8的分泌水平。 3为了研究celecoxib的抗凋亡、抑制细胞侵袭作用与NF-κB信号通路的关系,应用western blot方法检测了不同浓度celecoxib作用后MDA-MB-231细胞的p65、p50、IκBα(inhibitory kappaBα,IκBα)以及磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表达情况,并进一步通过western
blot法检测p65的核转位变化。采用凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic 和 mobility shift assay,EMSA)检测用药前后NF-κB DNA结合活性的改变。 4构建表达p65cDNA的真核表达载体,转染MDA-MB-231细胞,观察过表达p65基因对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,并通过与celecoxib联合作用,揭示celecoxib和NF-κB信号通路之间的联系。 5利用微小RNA(microRNA,miRNA)技术,构建表达p65miRNA的真核表达载体,沉默p65基因的表达,观察NF-κB信号通路阻断对人乳癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡以及侵袭的影响。 结果: 1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞生物学活性的影响 1.1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞增殖的影响 MTT分析结果显示,经celecoxib作用24h、48h和72h后,与溶剂对照组相比,对MDA-MB-231细胞增殖有明显的抑制作用(P0.05)。提示celecoxib不是通过COX-2和PGE2途径来抑制细胞的增殖。 1.2 Celecoxib对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 Celecoxib可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡,使部分细胞出现形态不规则、细胞核固缩聚集、空泡样变性、核碎裂等凋亡的形态学变化。Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察,有些细胞核内可见到有浓染致密的荧光颗粒,细胞核呈碎块状、颜色发白。随着celecoxib浓度的增加,凋亡细胞的比例也在逐渐增加,不同浓度组之间有显著差异(P<0.05),裂解蛋白表达上调(P<0.05)。Celecoxib还可以抑制MDA-MB-231组成性自分泌IL-8(P0.05)。 2.