7细胞分化成为成熟的破骨细胞。而且鹿角盘提取物可剂量依赖性地减少破骨细胞的数量,降低破骨细胞中TRAP的活性,从而抑制了RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞。LDH活性检验、PI染色和DNA碎片定量分析结果一致表明,鹿角盘提取物是通过诱导成熟的破骨细胞发生凋亡而抑制其活性。而且,RT-PCR检测结果表明鹿角盘提取物是通过下调破骨细胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9mRNA的表达,来抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,从而起防治骨质疏松症的作用。 (4)采用p38特异性抑制剂SB203580干预处理MG-63成骨细胞,进一步验证鹿角盘提取物的抗骨质疏松作用机制。 用p38特异性抑制剂SB203580干预处理成骨细胞,然后采用MTT法、ALP法、茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测分别评价SB203580对成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响。结果表明,SB203580可以有效地阻断鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化骨基质形成的促进作用。而且,用ELISA法和RT-PCR检测OPG和RANKL蛋白含量和基因的表达,结果显示鹿角盘提取物上调了OPG蛋白和mRNA的表达,下调了RANKL蛋白和mRNA的表达,且通过调控成骨细胞中OPG和RANKL的表达,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻断鹿角盘提取物对破骨细胞的抑制作用,提示鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路,双向影响成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡,从而起抗骨质疏松的作用。
综上所述,本研究证实了鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路来促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收,从而起抗骨质疏松的作用,为鹿角盘用于治疗骨质疏松症提供了理论依据。
目的：基于“肾主骨”理论，探讨补肾滋阴代表方剂左归丸促进骨形成作用，及JNK、p38/Smads信号级联对其影响，以探讨左归丸潜在促进骨形成的作用机制。 Selleckchem GDC941 无 材料与方法：采用血清药理学方法，将SPF级SD雌性大鼠60只（180~220g）按体质量随机分为空白对照组、左归丸组和倍美力组，每组各20只，依据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸等临床剂量为1.6g·Kg-1，大鼠倍美力结合雌激素片的等临床剂量为56.25μg·kg-1，使用前用蒸馏水将药物制成混悬液，空白对照组给予蒸馏水，灌服10ml·Kg-1体质量，2次·d-1，连续灌胃7d，末次给药2h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2h，2500r·min-1，4℃离心20min，收集上清，同组血清混匀，56℃水浴灭活30min，制备大鼠含药血清。采用MC3T3-E1成骨细胞系体外研究模型，用含10%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素）培养。细胞实验分为空白对照组（control）、SP600125组（SP）、SB203580组（SB）、左归丸组（ZG）、左归丸+SP600125组（ZG+SP）、左归丸+SB203580组（ZG+SB）、倍美力组（BML）、倍美力+SP600125组（BML+SP）、倍美力+SB203580组（BML+SB）。细胞接种24h后，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素），饥饿24h，吸弃旧培养液，加入含或不含JNK、p38MAPK特异抑制剂SP600125、SB203580(10μmol·L-1，溶于DMSO，体积分数0.05），但显著抑制了ZG诱导7d的ALP活性。
1.3JNK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞矿化作用的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d的矿化作用；加入SP600125后，显著抑制ZG和BML对矿化作用的诱导。 1.4JNK信号通路对左归丸含药血清干预Runx2和ALP蛋白表达的影响 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞48h的Runx2和ALP蛋白的表达；加入SP600125后，未能对抗ZG诱导48h的Runx2和ALP蛋白表达，也未能对抗BML诱导的Runx2蛋白的表达，但显著抑制了BML诱导的ALP蛋白表达。 2.p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞分化的调控 2.1左归丸含药血清能够诱导MC3T3-E1细胞p38MAPK信号通路活化 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞p38磷酸化蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对p38蛋白磷酸化的诱导作用。
Fulvestrant购买 2.2p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化不同阶段ALP活性的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞48h和7d的ALP活性（P＜0.01）；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对48h和7d的ALP活性的刺激作用（P＜0.01）。 2.3p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞14d矿化作用的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d矿化作用；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对细胞矿化的诱导作用。 2.4左归丸含药血清通过p38MAPK信号通路的活化上调Runx2蛋白的表达 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞Runx2蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对Runx2蛋白表达的诱导。 3.JNK、p38MAPK/Smads信号级联参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞功能的调控 3.1左归丸含药血清上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA表达 结果显示，与control组比较，ZG组和BML均组能显著上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA的表达（P＜0.01）。 3.2左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表达 结果显示，与control组比较，ZG组和BML组均能显著诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和p38蛋白的表达；ZG组明显优于BML组；加入SP600125或SB203580后，显著抑制ZG和BML对磷酸化JNK或p38蛋白的诱导作用。 3.3JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞增殖的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著促进MC3T3-E1细胞增殖（P＜0.01）；ZG组显著优于BML组（P＜0.01）；加入SP600125或SB203580后，抑制ZG组和BML组对MC3T3-E1细胞增殖的诱导作用（P＜0.05或P＜0.01）。 3.4JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞周期分布的调控 细胞周期分析结果显示，与control组比较，ZG组G1期的细胞百分率显著下降（P＜0.01），S期的细胞百分率变化不显著（P>0.05），G2/M期的细胞百分率显著增加（P＜0.