4%和39.6%,而在shRNA-STAT1转染的细胞中,Bortezomib诱导的CD14和CD11b仅为10.1%和19.6%。给与PD98059或SP600125抑制Bortezomib引起的HL60细胞分化的同时,观察到STAT1水平上调被抑制,活性水平被抑制,C/EBPa表达也受到抑制。上述结果表明Bortezomib激活的MEK/ERK-JNK通路可能通过进一步激活分化相关转录因子STAT1诱导AML细胞的分化。 3) Bortezomib诱导的AML细胞分化与凋亡为RARα非依赖的过程。 Western blotting结果显示,Bortezomib作用于HL60后,维甲酸受体RARa蛋白水平增加,但通过双荧光素酶检测系统检测结果显示,RARa转录活性无显著变化。同时流式细胞术检测结果表明Bortezomib能诱导RARa突变的HL60R细胞分化抗原CD11b的表达及凋亡的发生。以上结果提示Bortezomib诱导AML细胞的分化与凋亡是RARα非依赖的过程。

获悉更多 4) Bortezomib诱导AML细胞分化的同时,伴随着AML细胞的凋亡,并初步探讨Bortezomib引起的AML细胞分化与凋亡之间的关系。 Annexin V/PI双染流式细胞术检测结果显示,5 nM Bortezomib在诱导白血病细胞分化的同时,伴随了时间依赖性的细胞凋亡。但由MEK/ERK-JNK通路的抑制引起的Bortezomib细胞分化的抑制过程中,Bortezomib引起的细胞凋亡率无显著性变化。由此推测,Bortezomib诱导的AML细胞的分化与凋亡可能是两个相对独立的过程。 第二部分：Bortezomib通过抑制ATRA引起的RARa蛋白的降解,协同ATRA诱导AML细胞粒性分化。 VE-821分子量 1) Bortezomib协同ATRA诱导AML细胞粒性分化。 MTT检测法显示Bortezomib与ATRA联合作用能协同抑制HL60与NB4细胞的增殖。通过台盼蓝拒染法与血细胞计数板法,计数并绘制Bortezomib与ATRA联合作用后的细胞的增殖曲线和存活率曲线。结果显示Bortezomib(在HL60细胞上选用浓度2.5 nM,在NB4细胞上选用浓度2.5、5 nM)单药作用不影响细胞的存活率和细胞增殖能力,但能显著增强ATRA引起的细胞增殖抑制作用,而这种作用并不是通过诱导细胞死亡实现的。我们从形态学、生化指标及分子标志三方面指标证实了Bortezomib能促进ATRA诱导的HL60、NB4细胞的分化,具体表现为与ATRA单用组相比,药物联用组引起的核分叶比例显著增加,NBT还原能力显著增强,分化抗原CDllb表达量显著增加。

在人原代白血病细胞上,ATRA与Bortezomib也具有协同作用。在M3-AML型、AML/ALL混合型、AML-resistance型三个原代病人骨髓中分离得到原代白血病。通过细胞计数或CCK8检测,结果显示两药联合作用后细胞存活率显著低于单用组。在M3-AML型原代病人样本上,Bortezomib增强了ATRA引起的细胞NBT还原能力。 2) Bortezomib联合ATRA通过诱导HL60细胞分化,抑制裸小鼠HL60移植瘤的生长。 裸小鼠HL60人白血病细胞移植瘤实验结果显示,ATRA (5 mg/kg)组及Bortezomib (0.1 mg/kg)组均表现出一定的抗肿瘤作用,其T/C%值分别为58.0%和62.0%,抑瘤率分别为40.0%和20.0%,联合作用组T/C%值和抑瘤率分别为45%和58.9%,说明Bortezomib与ATRA在体内也有较好抗肿瘤协同作用。通过分离得到瘤组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测,显示联用组瘤组织中分化抗原CD11b的表达率为53.1%,显著高于ATRA单用组(40.4%)和Bortezomib单用组(38.6%)。从免疫组化结果也得出类似的结果,在联用组中C/EBPε的表达量明显高于对照组与单药组。此外,采用TUNEL染色检测了瘤组织中的凋亡情况,显示该剂量配比下,瘤组织中几乎检测不到凋亡的发生。

购买Doxorubicin 3) Bortezomib协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究 20S蛋白酶体活性检测结果表明,蛋白酶体活性在ATRA诱导的HL60和NB4细胞分化过程中明显上调,Bortezomib显著抑制了这一上调现象。与之对应的,在ATRA诱导的HL60和NB4细胞分化过程中RARα蛋白经泛素蛋白酶体通路介导呈下调趋势,Bortezomib与ATRA联合作用后,RARα蛋白得以累积,而其mRNA水平无显著性变化。RARα与维甲酸反应元件RARE结合能直接介导转录因子STAT1的表达。ATRA能诱导STAT1的表达,Bortezomib与ATRA联合作用后,STAT1 mRNA水平显著增加。以上结果提示了Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,增强了RARα转录活性。Western blotting检测瘤组织中RARα蛋白的表达含量,结果显示Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,联用组中RARα蛋白含量显著高于ATRA单用组。 Western blotting结果显示ATRA上调了STAT1蛋白水平和Tyr701位点磷酸化水平,Bortezomib与ATRA联合作用进一步上调STAT1的蛋白水平和活性,而该浓度Bortezomib单独作用对其无显著影响。免疫荧光结果显示合用组细胞核中STAT1的分布显著增加,EMSA检测结果进一步证实提示了STAT1与DNA结合能力显著增加。慢病毒介导的shRNA-STAT1显著下调了HL60细胞中的STAT1蛋白水平,同时部分逆转了Bortezomib对ATRA诱导的细胞分化的协同作用。以上结果显示STAT1参与了Bortezomib协同ATRA诱导细胞分化的过程。 免疫荧光结果显示,p65在ATRA单用组、与Bortezomib联用组细胞中的分布无显著性差异。此外,ATRA或Bortezomib单用组中MEK活性增强,但联用组与单用组MEK活性无显著性差别。JNK通路活性在ATRA与Bortezomib联合诱导细胞分化过程中变化不大。以上结果显示了NFκB通路与MEK.