体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 Alisertib临床试验 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,10μM)；2.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；置细胞培养箱孵育。

2.基因转染 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞实验各组细胞。转染48h后,将培养基更换为不含血清的DMEM培养基,并进行后续实验。 3.细胞存活率的检测 使用MTT方法检测小胶质细胞存活率。4.细胞凋亡检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。5. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt和cleaved caspase-3等蛋白水平变化。 结果 1.吗啡处理引起小胶质细胞P-arrestin 2蛋白水平降低 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平明显降低,而P-arrestin 1蛋白水平无明显变化。纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡引起的小胶质细胞凋亡 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。MTT检测细胞存活率,发现高表达P-arrestin 2可减少吗啡处理引起的细胞存活率下降。而RNA干扰减少β-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞存活率下降。采用TUNEL方法检测细胞凋亡,发现高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的细胞凋亡。而RNA干扰减少P-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞凋亡。Western Blot结果显示高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的caspase-3激活,而RNA干扰减少β-arrestin Selleck AZD2281 2水平,可增加吗啡处理引起的caspase-3激活。 3.β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用 将携带β-arrestin2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。Western

Blot结果显示,高表达P-arrestin 2可缓解吗啡引起的phosphor-Akt水平降低,而通过RNA干扰降低P-arrestin 2水平,可增加吗啡引起的phosphor-Akt降低。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径引起小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平降低。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡处理引起的小胶质细胞凋亡。 3.高表达β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用。
目的：1.观察在脂多糖激活原代培养大鼠小胶质细胞模型中,TNFα和HMGB1蛋白表达及TNFαmRNA和HMGB1mRNA表达的时间依赖性。2.观察NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)和p38MAPK抑制剂SB 203580对体外TNFα诱导的原代培养大鼠小胶质细胞HMGB1蛋白表达及mRNA的影响。3.观察鞘内注射Etanercept对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)大鼠痛阈和脊髓小胶质细胞活性、NF-κBp-p65、p-p38MAPK、HMGB1表达的调节,并探讨其临床疼痛治疗的机制。

方法：1.用脂多糖(100ng/ml)刺激原代培养大鼠小胶质细胞,根据不同的指标设定取样时间点(Oh,2h,4h,6h,8h,12h,16h,18h,24h),用ELISA法检测相应时间点细胞培养上清中TNFα和]HMGB1表达情况,用Western Blot检测细胞裂解液HMGB1表达情况,用RT-PCR检测TNFαmRNA和HMGB1 mRNA的表达。2.采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立两部分,分别用PDTC和SB http://www.selleck.cn/products/mi-773-sar405838.html 203580处理。第一部分设立对照组、TNFα(25ng/m1)组、TNFa+PDTC组、PDTC组,第二部分设立对照组、TNFα组、TNFα+ SB 203580组、SB 203580组,均孵育16h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1表达情况、Western blot检测细胞HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测HMGB1 mRNA表达。3.252只成年雄性SD大鼠,体质量250～300g,鞘内置管成功后,随机分为7组(n=36)：正常对照组：实验大鼠不做任何处置；假手术组：仅暴露左侧坐骨神经不结扎；假手术+Etanercept组：假手术处理大鼠并经鞘内置管注入Etanercept组；CCI组：大鼠CCI手术处理；CCI+Etanercept组。鞘内置管3d后按每组处理不同,开始鞘内输注生理盐水和Etanercept,每2d鞘内给药一次,鞘内注射2d后分别建立大鼠CCI神经病理性疼痛模型和假手术模型,测定大鼠的痛敏值,并在CCI后第3,7,13天处死大鼠,取脊髓腰膨大部进行免疫组化测定OX42表达、用Western Blot检测HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测(?)HMGB1 mRNA表达。 结果：1.LPS刺激后大鼠小胶质细胞形态呈巨噬细胞样变化;TNFα的分泌于8h达峰值,细胞内及细胞外HMGB1的分泌分别于18h和24h达峰值,TNFαmRNA的表达于2h即达峰值,HMGB1mRNA自8h开始增加,12h达峰值。2.TNFα刺激后大鼠小胶质细胞裂解液及上清液中均有HMGB1蛋白表达增高,PDTC可抑制TNFα诱导的NF-κBp-p65核表达,并下调HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的表达；SB 203580可抑制TNFα诱导的p-p38MAPK表达(P<0.01),同样下调HMGB1蛋白和HMGB1mRN的表达。3.CCI组与Sham组比较大鼠术后各时点痛敏阈值明显下降,并在术后第3d降至最低点(P<0.01),脊髓OX42、p-p65、p-p38MAPK的表达明显升高(P<0.

22±12.3ng/dl(n=3),雌激素浓度0.05)。FSH组睾酮水平和基础培养基组未见明显统计学差异(p>0.05)，在这三组中均未检测到雌激素水平的改变。结论：通过本实验的分离和培养方法可以得到大量贴壁生长的卵泡膜间质细胞，其中很少有颗粒细胞的混杂，此方法可以快速、高效的进行小鼠卵泡膜间质细胞的分离培养。
目的：探讨快速眼动睡眠剥夺（REMSD）对小鼠海马tau蛋白磷酸化、磷酸化p38MAPK及GSK3β的影响。 方法：将32只8周龄SPF级雄性健康昆明小鼠随机分为对照组、REMSD24h、REMSD48h及REMSD72h组。对照组置于普通笼中饲养，REMSD组置于SD箱中饲养，各组在开始实验前先让小鼠熟悉环境3d。在实验后，迅速颈椎脱臼处死小鼠，取出脑组织经固定、脱水及包埋之后做成石蜡切片，用HE染色法观察各组小鼠海马形态结构的变化。利用免疫组织法观察总tau蛋白（T-tau）、磷酸化tau蛋白（p-tau）、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）及糖原合成激酶-3β（GSK3β）在小鼠海马组织的表达情况，并用Image-Proplus6.0图像分析软件测定平均光密度值（OD值）来反映各项指标表达的变化。

结果：HE染色显示在光镜下对照组海马内神经元均匀分布，形态规则，排列致密、整齐，细胞核结构清楚，核内染色质清晰可见，呈蓝色；REMSD组中，剥夺睡眠24h后海马内神经元结构即发生改变，细胞排列欠整齐，REMSD72h组细胞结构损伤较明显，细胞排列疏松，部分细胞呈萎缩状，胞浆呈嗜酸变性，细胞核结构不清，染色质颗粒欠清晰，部分神经元胞浆减少、细胞核固缩浓染。免疫组化结果显示，无论对照组或是REMSD组，T-tau平均OD值均无明显差异。对照组、REMSD24h、48h及72h组小鼠海马p-tau平均光密度（OD值）分别为0.1040.007、0.1560.027、0.1800.030和0.1880.032（P＜0.05），REMSD各组均高于对照组，差异有统计学意义；p-p38MAPK平均OD值分别为0.1690.028、0.2090.020、0.2390.017和0.2660.035（P＜0.05），REMSD各组均高于对照组，且随着时间的延长平均OD值也增加；GSK3β平均OD值分别为0.0840.009、0.0900.008、0.1030.011与0.1170.013（P＜0.05），REMSD48h及72h组均高于对照组与REMSD24h组，同时72h组高于48h组，而REMSD24h组与对照组之间差异无统计学意义。

AUY-922溶解度 Proteasome cleavage 结论：REM睡眠剥夺可以引起tau蛋白磷酸化水平的增高，其中可能有p38MAPK与GSK3β的参与。
目的探讨在乙酸诱导的急性内脏痛模型中,小鼠前扣带回皮质(ACC)内磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达的时空变化及可能作用。 方法本研究采用正常的成年雌性昆明小鼠作为研究对象。实验组小鼠腹腔注射0.6%的乙酸(10ml/kg)建立急性内脏痛模型,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。实验以腹壁收缩次数为指标观察动物的内脏痛反应。采用免疫组织化学和Western Blot检测小鼠ACC内p-ERK1/2表达的时程变化,免疫荧光双标法检测p-ERK1/2在GABA能神经元的表达情况。为了探讨ERK1/2的活化对乙酸诱导的小鼠内脏疼痛及痛相关的焦虑样行为的影响,在注射乙酸30分钟前皮下给予小鼠MEK的抑制剂SL327(30mg/kg)抑制ERK1/2的磷酸化,然后检测小鼠的痛反应及痛相关的焦虑样行为。

结果腹腔注射乙酸后小鼠前扣带回皮质区p-ERK1/2呈双相性增高表达：腹腔注射0.6%的乙酸后1小时内小鼠的腹壁收缩次数明显高于对照组(p0.05),但在乙酸注射1hr时小鼠ACC内p-ERK1/2的表达又有明显增强,与对照组相比阳性细胞数明显增多(p0.05)。同时,Western 可能 Blot结果还显示小鼠ACC内总ERK1/2在各时间点的表达实验组与对照组相比没有明显的差异(p>0.05)。 注射乙酸10mmin时小鼠前扣带回皮质内p-ERK1/2与GAD没有明显的共表达：免疫组织化学和Western Blot结果均显示在乙酸注射10min时小鼠ACC内p-ERK1/2的表达达到峰值,为了检测此时ACC内p-ERK1/2在何种细胞类型中表达,我们采用免疫荧光双标法检测了p-ERK1/2与GAD67(GABA能神经元标记物)的共表达情况。结果发现ACC内p-ERK1/2与GAD67没有明显的共存。 皮下注射MEK的抑制剂SL327不能有效减轻乙酸诱导的小鼠内脏疼痛反应,但能有效缓解小鼠痛相关的焦虑样行为：小鼠皮下给予SL327(30mg/kg)或同剂量的DMSO (SL327的溶剂),30分钟后再向两组小鼠腹腔给予0.6%的乙酸。免疫组织化学结果显示乙酸注射10min时实验组(SL327组)小鼠ACC内p-ERK1/2的免疫阳性细胞数与对照组(DMSO组)相比明显减少(p0.05)；高架十字迷宫结果显示乙酸注射2小时后SL327组小鼠在开放臂停留的时间百分比明显高于对照组,差异具有显著性(p<0.

TTC结果：模型组24h相对梗死体积为24.73±0.97％，干预组24h相对梗死体积为13.46±0.64％，差异有显著性(P<0.05）；干预组：干预后可以显著减少大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡细胞数量，与模型组相比，干预组除了再灌注后2h外其它时间点凋亡细胞数均明显减少（P
现如今，肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。在我国，近年来恶性肿瘤已成为死因谱中第一位的死亡原因，严重危害人们的健康和生命。因此，肿瘤的预防和控制已经成为当前最重要的卫生工作之一。研究表明，人类约有40%~60%的肿瘤是由化学因素引起的，而化学因素又主要与饮食有关。因此，对肿瘤的膳食预防是一项积极的防癌策略。近几年，膳食中的抗癌、防癌物质已经成为肿瘤化学预防的研究热点。牛磺酸(Taurine，Tau)是具有简单化学结构的含硫氨基酸。人体内Tau的含量较高，约占人体体重的0.1%，几乎全部以游离形式存在于所有脏器中。大量的国内外研究及临床应用发现，Tau具有广泛的生理功效，是机体内源性抗损伤物质，但是关于Tau抗肿瘤作用方面的研究较少，作用机制也尚未明确。

Ivacaftor 目的： 观察Tau对肿瘤细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。 方法： 检测Tau对肿瘤细胞生长的影响。实验采用4株肿瘤细胞和1株人正常细胞，分别是人乳腺癌细胞MCF-7（p53野生型，p53+/+）和MDA-MB-231（p53突变型，p53-/-）、人结肠癌细胞LoVo（p53+/+）和HT-29（p53-/-）以及人胚肾细胞293T。用不同浓度（0mM、10mM、20mM、40mM、80mM、160mM）的Tau分别处理4株肿瘤细胞和人胚肾细胞一定时间后，MTT检测其细胞活性的改变；应用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率的改变；应用Hoechst33342核染法观察肿瘤细胞凋亡的形态学改变；RT-PCR和Western blot方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、Bcl-2的mRNA及蛋白水平的表达变化；分光光度法检测MDA-MB-231的Caspase-3活性变化。 应用脂质体转染的方法将PUMA特异性siRNA（PUMA-siRNA，si-PUMA）转染人结肠癌细胞LoVo，检测PUMA沉默后对Tau诱导肿瘤细胞凋亡的影响。用lipofectamine2000（lipo2000）包裹不同浓度的带有荧光标记的FAM-siRNA（si-FAM）转染LoVo细胞，检测其转染效率。在筛选si-PUMA片段的实验中，将实验分为6组：①Control组，②siRNA片段Ⅰ，③siRNA片段Ⅱ，④siRNA片段Ⅲ，⑤阳性对照组（Positive 或者 Control，PC），⑥阴性对照组（Negative Control，NC），并转染48h后，用RT-PCR和Western blot方法检测各组PUMA表达情况，筛选出沉默效率较高的si-PUMA片段。为检测PUMA对Tau诱导肿瘤细胞凋亡的影响，采用瞬时转染法将si-PUMA转染LoVo细胞，实验分为4组：①Control组，②NC组，③si-PUMA组，④si-PUMA+Tau80mM组。实验于48h后，采用流式细胞术检测LoVo的细胞凋亡率；Western

blot方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、Bcl-2蛋白的表达变化。

结果： 随着Tau浓度和处理时间的增加，4株肿瘤细胞的增殖活性均出现降低趋势，Tau对肿瘤细胞的抑制率出现逐渐升高趋势。计算Tau作用48h后的IC50发现，人乳腺癌细胞MCF-7（p53+/+）的IC50（133.61mM）比MDA-MB-231（p53-/-）的IC50（127.21mM）大1.05倍，人结肠癌细胞LoVo（p53+/+）的IC50（297.81mM）比HT-29（p53-/-）的IC50（45.66mM）大4.76倍，提示Tau对p53-/-肿瘤细胞抑制作用更加明显。但Tau作用于正常人胚肾细胞293T24h和48h后，其细胞活性并无显著性影响，只是在72h后的较高浓度组对293T细胞出现轻微抑制，这就提示Tau对人正常细胞的增殖影响并不明显。流式细胞术结果发现，随着Tau浓度的增加，两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高，并且p53-/-细胞比p53+/+细胞的凋亡率增加更加明显，这与MTT结果相似。Hoechst33342核染色发现，Tau80mM处理48h后，肿瘤细胞的细胞核均出现不同程度的致密浓染或碎块状致密浓染的典型的细胞凋亡形态。RT-PCR图像分析显示：随着Tau浓度的增加，两组肿瘤细胞的促凋亡基因PUMA，BAX 这个 mRNA表达水平都出现上调，抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平出现下调。Western blot结果显示：随着Tau浓度的增加，两组细胞中促凋亡蛋白PUMA和BAX水平出现明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显下调。Caspase-3活性检测发现，Tau处理MDA-MB-231细胞48h后，Caspase-3活性显著升高，Tau40mM是Control组的（1.33±0.13）倍，Tau80mM是Control组的（3.25±0.16）倍，Tau160mM是Control组的（4.39±0.24）倍。 不同浓度的si-FAM转染LoVo细胞，表现出不同的转染效率。当si-FAM浓度为100nM时转染效率比较高，为61.34%。RT-PCR和Western blot结果发现，3个siRNA片段都不同程度的下调了PUMA mRNA和PUMA蛋白的表达，其中siRNA片段Ⅱ下调PUMA表达效果最显著。siRNA特异性干扰LoVo细胞PUMA基因表达后，si-PUMA组的早期凋亡率（5.16±0.19）%和晚期凋亡率（4.29±0.35）%较Control组早期凋亡率（9.39±0.32）%和晚期凋亡率（7.50±0.34）%相比均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。si-PUMA+Tau组的早期凋亡率（9.52±0.35）%和晚期凋亡率（9.28±0.11）%与si-PUMA组相比均出现升高，差异有统计学意义（P<0.05）。而si-PUMA+Tau组早期凋亡率与Control相比没有明显差异，但是其晚期凋亡率较Control组（7.50±0.

细胞分组:分为4组,即15mmol/LGLU组(高糖组)、100μg/mLAGEs组(AGEs组)、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs组(高糖+AGEs联合组)及对照组。 5.细胞培养液上清TNFa水平检测:采用ELISA方法进行。 6.细胞培养液上清中MDA水平检测:采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA),严格按照试剂盒说明步骤检测。 7.RT-PCR法检测HO-1mRNA表达:提取总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),两步法进行RT-PCR,扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。 8.免疫印记(western blot,WB)法检测HO-1蛋白表达:提取总蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectropheresis,SDS-PAGE),电转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC)封闭非特异位点。利用多克隆兔抗人HO-1抗体及HRP标记的二抗与NC反应,DAB显色后拍照分析条带亮度。 9.SB203580(SB,p38MAPK抑制剂)干预实验:分为高糖组、SB+15mmol/LGLU(SB+高糖)组、AGEs组、SB+100μg/mLAGEs(SB+AGEs)组。10μmo/LSB干预30min后换以含15mmol/LGLU或100μg/mL AGEs细胞培养液继续孵育24h,收集细胞进行RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平。 10.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理;实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,相关分析采用积矩相关系数(Pearson相关系数)分析,检验标准为α=0.05。

查找更多 【结果】 1.制备的AGEs浓度:AGEs的荧光浓度为101.29U/mg,对照BSA的荧光浓度为13.68 U/mg,前者为后者的7.40倍。 2.GLU和AGEs刺激THP-1细胞的ROS产量:均表现为0.5h的ROS产量急剧升高,随着时间延长轻度下降,但于24h再度上升至较高水平,在6h、24h时间点的ROS产量表现为GLU和AGEs浓度依赖性升高。高糖组(65.88±1.61)和AGEs组(67.46±3.78)的ROS产量均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(107.21±8.94)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.01),且高糖和AGEs对ROS产量的影响具有协同作用(P＜0.05)。 3.细胞培养液上清的MDA水平(nmol/mL):高糖组(1.59±0.53)显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.05),AGEs组(1.56±0.97)虽然也高于对照组,但统计学差异不明显(P＞0.05),高糖+AGEs联合组(3.26±0.32)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.05)。 4.细胞培养液上清的TNFa水平(pg/mL):高糖组(25.38±1.95)和AGEs组(24.43±2.65)显著高于对照组(14.97±1.49)(P＜0.01),高糖+AGEs联合组(51.25±1.72)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.001),高糖和AGEs对TNFa的影响存在协同作用(P＜0.001)。

很少 5.细胞HO-1mRNA的表达:高糖组(0.42±0.02)和AGEs组(0.48±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(0.89±0.12)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05)。 6.THP-1细胞的HO-1蛋白表达:高糖组(0.39±0.01)和AGEs组(0.45±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.05),高糖+AGEs联合组(0.81±0.02)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05),高糖和AGEs存在协同作用(P＜0.01)。

7.相关分析:HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA、ROS产量、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。HO-1mRNA与ROS、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。ROS产量与MDA、TNFα呈显著正相关(P＜0.001)。TNFα与MDA呈显著正相关(P＜0.001)。 8.SB203580(SB)(p38MAPK抑制剂)干预实验结果:各组之间HO-1mRNA表达均无显著的统计学差异(P＞0.05)。 【结论】 1.高糖和AGEs单独刺激能导致THP-1细胞氧化损伤加剧、分泌炎症因子TINFα水平及HO-1表达增高,二者联合刺激能使上述改变进一步加剧。 2.p38MAPK抑制剂对高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1mRNA表达无显著影响。 3.HO-1表达与细胞氧化损伤及炎症指标呈显著正相关,提示高糖和AGEs导致THP-1细胞氧化损伤及炎症反应,后者诱导HO-1表达适应性和代偿性增高,从而发挥细胞保护作用。 第二章抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 【目的】 探讨抑制HO-1表达对高糖和AGEs刺激下THP-1细胞氧化应激的影响。 【方法】 1.细胞分组:分为4组,即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(GLU+AGEs)组、ZnPP组及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(ZnPP+GLU+AGEs)组,其中对照组和ZnPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 那个 2.细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.各组细胞ROS产量(MFI)的比较:ZnPP+GLU+AGEs组(128.81±5.53)、GLU+AGEs组(107.21±8.94)和ZnPP组(51.56±2.09)均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.05),而ZnPP+GLU+AGEs组显著高于GLU+AGEs组及ZnPP组(P＜0.05)。 2.各组细胞培养液上清MDA水平(nmol/mL)的比较:ZnPP组(1.61±0.10)、GLU+AGEs组(3.26±0.32)、ZnPP+GLU+AGEs组(3.75±1.25)的MDA水平均显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.01),其中ZnPP+GLU+AGEs组显著高于ZnPP组(P＜0.05),但与GLU+AGEs组相比无显著性差异(P＞0.05)。 3.各组细胞培养液上清TNFa水平(pg/mL)的比较:ZnPP组(27.34±10.18)、GLU+AGEs组(38.09±14.97)、ZnPP+GLU+AGEs组(141.10±12.

MTS检测WP1066对骨髓瘤细胞的增殖抑制作用。 8.流式细胞仪检测WP1066对骨髓瘤细胞的诱导凋亡作用以及western blot及MSD检测凋亡相关基因表达变化。 结果 1. RT-PCR结果表明骨髓瘤细胞表达TLRs mRNA包括TLR 1-2,4-7和9,本课题重点研究TLR4,细胞株株MM.1S、MM.1R和ARP-1细胞表达TLR4,而U266细胞表达不明显,同时,用PE染色的TLR 4流式抗体检测了各细胞TLR4的表达情况,根据TLR 4峰的右移程度来判断表达的高低,TLR4峰右移越明显,则表明蛋白表达越高。结果发现MM.1S. MM.1R和ARP-1细胞明显表达TLR4,而U266细胞表达不明显。这个流式结果从蛋白角度表明TLR 4表达在细胞表面,而且我们还证实TLR4蛋白同时在原代骨髓瘤细胞表达。 2.TLR4的配体LPS (0、1、2、4μg/ml)刺激MM细胞后48h后,TLR4阳性表达的MM细胞株MM.1S、MM.1R和ARP-1细胞出现明显增殖,而TLR4表达阴性的MM细胞株U266增殖不明显。我们先用LPS(2μg/ml)刺激4 h,再加入阿霉素0.4μg/ml刺激24 h,最后AnnexinV /P I双染色流式检测,结果发现MM.1S和ARP-1对阿霉素诱导的凋亡有明显的抵抗作用,MM.1S细胞经LPS刺激后,阿霉素诱导的凋亡率从(79.01±15)%降至(38.73±8.5)%(P0.05],L PS不能保护阿霉素对U 266的诱导凋亡作用。而且LPS诱导细胞周期改变,LPS Alisertib (2μg/ml)处理细胞12、24和48小时后,细胞G0/G1期细胞明显减少,S期细胞明显增多。 3.TLR4的配体LPS诱导MM细胞株MM.1S和ARP-1细胞MAPK信号家族因子ERK、JNK和p38磷酸化,并增加核转录因子NF-κB蛋白表达增加,呈时间依赖,我们使用LPS作用细胞20、60和180min,结果发现LPS作用细胞20min即出现ERK和JNK磷酸化,而p38磷酸化在LPS作用细胞60min后明显,而且我们使用ERK1/2抑制剂U0126(25μM),JNK抑制剂SP600125(50μM)和p38抑制剂SB20358

(50μM)作用MM.1S细胞1小时后,LPS作用细胞48小时检测细胞增殖,我们发现LPS促进细胞增殖作用依赖MAPK信号通路。 4.使用real-time PCR方法检测了LPS对MM细胞株MM.1S细胞免疫调节分子B7-H1、B7-H2、CD40、VEGF和TGF-β的表达,结果发现LPS明显增加B7-H1和B7-H2的表达,少量增加CD40表达,TLR4活化的骨髓瘤细胞抑制健康供者外周血T细胞增殖。 5.TLR4的配体LPS (2μg/ml)作用MM细胞株MM.1R、MM.1S、ARP-1和U266细胞48小时,ELISA检测细胞上清IL-6、IL-12和IL-18分泌,结果发现LPS促进MM.1R、MM.1S和ARP-1细胞IL-18分泌,促进ARP-1细胞IL-6分泌,而对IL-12分泌无明显影响。而且我们进一步证实LPS对IL-18分泌的影响通过TLR4和MAPK途径。 6.研究发现在骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞,U266细胞STAT3持续激活,而MM.1S和ARP-1在自然情况下无STAT3激活。我们选择MM.1S和ARP-1细胞株,应用一整套细胞因子和生长因子,包括EGF 50ng/ml、bFGF 20ng/ml、G-CSF 20ng/ml、Erythropoirtin 有 10 IU/ml, IFNa-2a 50000IU/ml, IFNβ20ng/ml, IFNγ20ng/ml, IL-220ng/ml、IL-420ng/ml、IL-650ng/ml、IL-720ng/ml、IL-8 20ng/ml、IL-10 50ng/ml、IL-12 20ng/ml、IL-15 20ng/ml、IL-16

20ng/ml、IL-20 20ng/ml和IL-22 20ng/ml分别在细胞血清饥饿状态刺激30分钟,结果发现细胞因子IL-6、IFNα和IFNβ促使骨髓瘤细胞STAT3和STAT5磷酸化,而且我们还比较了血清饥饿状态和10%血清浓度下细胞对细胞因子的反应,结果发现无论在血清饥饿或血清培养状态,细胞因子IL-6、IFNα和IFNβ都能刺激STAT3和STAT5磷酸化。 7.我们检测了新颖的JAK/STAT3抑制剂WP1066对骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266的增殖抑制作用。使用WP1066浓度0.5-10μM,作用细胞24、48和72小时,MTS检测增殖抑制作用。结果发现细胞株ARP-1的IC50是24小时为3.25μM；48小时为2.74μM,72小时为1.67μM,细胞株MM.1S的IC50是24小时为3.77μM,48小时为3.20μM,72小时为2.32μM,细胞株U266的IC50是24小时为8.81μM,48小时为4.61gM,72小时为2.15μM。同时我们也检测了WP1066对骨髓瘤原代CD138+细胞的增殖抑制作用,CDl38-细胞作为对照,WP1066对骨髓瘤原代CD138+细胞有明显增殖抑制作用,24小时IC50为5.674μM,而CD138-细胞的24小时IC50大于10μM。 8. JAK/STAT3抑制剂WPl066诱导骨髓瘤细胞凋亡,凋亡相关基因caspase3和PARP裂解。我们使用WPl0661、2和5μM作用骨髓瘤细胞株MM.1S、ARP-1和U266细胞24小时,AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡,并使用MSD和western blot检测裂解的caspase3和PARP,结果发现WPl066诱导细胞凋亡呈浓度依赖,而且在细胞凋亡过程中,凋亡相关基因caspase3和PARP发生裂解。 MI-773 9. JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WPl066抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,呈浓度和时间依赖。我们使用AG490浓度50、100和300μM, CABE浓度50和100μM和WPl066浓度2.5、5和10μM作用MM细胞株MM.1S和ARP-1细胞5小时,IL-6作用细胞30分钟,MSD和western blot检测磷酸化的STAT3蛋白,结果发现AG490、CABE和WPl066抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,呈浓度依赖,其明显作用浓度分别AG490为300μM, CABE为100μM和WP1066 5-10μM,而且我们还研究了药物作用的时间梯度,我们分别使用300μM AG490, 100μM CABE和5μM WP1066作用细胞1、4和6小时,检测磷酸化的STAT3蛋白,我们发现药物对STAT3蛋白磷酸化的抑制作用同样呈时间依赖,最大作用时间为6小时。 10. JAK/STAT3抑制剂AG490、CABE和WPl066抑制IFNα诱导的STAT3磷酸化。我们使用AG490和CABE浓度50、100和300μM, WP1066浓度2.