05),均未出现明显统计学差异,增大样本量有可能出现。模型组心脏体重指数高于假手术组(P<0.05),氯沙坦组明显低于模型组(P0.05)。川芎嗪组、Garlicin 1组的血浆中AngⅡ水平较模型组明显降低(P<0.05),四个治疗组与模型组相比出现明显的降低(P
血吸虫病是人类主要热带病之一。血吸虫病主要死于肝虫卵肉芽肿以及继发性的肝纤维化。有研究显示,杀虫治疗后未成熟虫卵仍可继续发育,血吸虫虫卵肉芽肿反应仍在继续,而且,一旦肝纤维化达到一定程度,即使去除了肝纤维化诱因,纤维化仍将继续发展。因此,如何在肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期,用药物干预以预防其发展,是杀虫治疗后第二个控制疾病发展的关键。然而至今无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。 目前已证实,肝星状细胞(hepatic

stellate cells,HSCs)是分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),引起肝纤维化最主要的细胞,转移生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGFβ1)是其最强的促ECM分泌因子。但TGFβ1对血吸虫病肝纤维化的影响,目前仍有争议。 芍药苷(paeoniflorin,PAE)是从白芍中提取的主要有效成分。以往的研究发现,芍药苷具有免疫调节、抗炎等作用,但其在日本血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化中的作用,国内外未见报道。 时间 本课题用血吸虫尾蚴感染小鼠,制成血吸虫病肝肉芽肿和纤维化模型,考察PAE在体内对肝肉芽肿和纤维化以及TGFβ1的影响,然后在体外考察血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PMs)分泌TGFβ1的影响,以及TGFβ1和PAE对HSCs增殖和分泌胶原的影响。最后从基因和蛋白表达水平探讨PAE对TGFβ1-Smads信号转导通路的作用,以期了解PAE抗肝纤维化的部分机制。 SP600125临床试验 目的:研究PAE对小鼠日本血吸虫病肝纤维化TGFβ1-Smads信号转导通路的影响 方法:用血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,然后在感染后不同时间,分先后或同时给予吡喹酮和不同剂量PAE,用组织芯片HE染色和免疫组化技术了解PAE在杀虫不同时期对肝肉芽肿、肝纤维化形成和TGFβ1表达的影响;用SEA刺激PMs,分别用反转录多聚酶链反应(reverse

transcriptase polymerase

chain reaction,RT-PCR)、Western blotting以及酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析SEA和PAE对PMs产生TGFβ1的影响;用原位灌流-密度梯度离心法提取正常健康小鼠HSCs,经SEA刺激的腹腔巨噬细胞条件培养基(stimulated peritoneal macrophage-conditioned medium,Stimulated-PMCM)刺激HSCs后,用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法和ELISA分别观察PMCM和PAE对HSCs增殖和分泌胶原的影响。我们选择稀释度为1:2的PMCM为最适浓度的巨噬细胞条件培养基(optimum macrophage-conditioned medium,OPMCM),然后,在OPMCM中加入抗TGFβ1单抗,以了解TGFβ1对HSCs增殖和胶原分泌的影响。最后,用RT-PCR和Western blotting分析PAE对HSCs中的Smads信号蛋白以及前胶原转录和合成的影响。 结果: 1.早期给予PAE可预防血吸虫病小鼠肝肉芽肿和肝纤维化的形成,降低肝内TGFβ1表达 感染血吸虫尾蚴后第12 d(在杀虫治疗前第30 d)开始给予PAE(30、120 mg/kg),能显著降低肝肉芽肿大小和肝纤维化程度,以及降低TGFβ1在肝组织中的表达,而在感染后第42 LY294002供应商 d(在杀虫治疗同时)或第72 d(在杀虫治疗30 d后)开始给予PAE则无上述作用。说明血吸虫感染后,早期给予PAE能预防肝肉芽肿和肝纤维化;同时也说明,肝纤维化可能与TGFβ1的表达有关。 2. SEA促进PMs分泌TGFβ1,而PAE抑制TGFβ1的分泌 ELISA、RT-PCR和Western blotting都显示SEA(0、2.5、5、10、20、40 mg/L)能刺激PMs分泌TGFβ1,且SEA在10 mg/L时能刺激PMs产生最大量的TGFβ1;同时,RT-PCR和Western blotting显示,PAE(0、7.5、15、30、60、120 mg/L)能浓度依赖性地抑制PMs产生TGFβ1。提示PAE抗肝纤维化的机制可能与其抑制PMs分泌TGFβ1有关。 3.

05),在冠状血管ADM阳性表达面积和平均光密度明显明显低于3dEP组和C组(p<0.05)。(7)3dEP组心肌ADM含量与C组相比,差异不具有显著性;3wEP组心肌ADM含量明显高于C组(p
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿瘤。资料表明,目前我国乳腺癌发病率正以每年2%-3%的速度递增,10年间我国主要城市的乳腺癌发病率增长了37%。特别是在30-54岁年龄组中,乳腺癌已成为威胁女性健康的“头号杀手”。受体三阴性乳腺癌(triple-negative

Ipatasertib分子量 breast cancer, TNBC)是近些年学者提出的一个新的乳腺癌亚型,是指肿瘤细胞膜表面缺乏雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的一类乳腺癌。TNBC的发病率占乳腺癌总发病率的11%-20%,尤其好发于年轻女性,且该类乳腺癌具有术后易复发、易远处转移和预后差的特点,对内分泌治疗和针对HER-2的靶向治疗无效,至今仍缺乏令人满意的综合治疗方案。 近年来,非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)在抑制肿瘤活性方面展示了很好的应用前景,大量体内外研究显示,常规服用NSAIDs可以大幅度降低乳腺癌等多种肿瘤的发病风险,因此,该类药物引起了广大学者的关注。Harris等研究发现,新一代特异性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂celecoxib,不仅能明显延迟肿瘤的发生,还可以降低乳腺癌的发病率及肿瘤体积。目前,有学者研究认为,celecoxib的抗肿瘤作用机制可能与降低肿瘤组织COX-2表达、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡有关。但也有学者认为celecoxib的抗肿瘤作用机制并不是依赖抑制COX-2途径,其具体作用机制目前尚存在争议。 Kim和Subhashini等研究报道,celecoxib可通过NF-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)途径抑制宫颈癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡。而NF-κB活性失控与肿瘤的形成密切相关,且TNBC中NF-κB异常活化,因此我们想阐明在TNBC中celecoxib是否主要通过下调异常活化的NF-κB而发挥作用。 NF-κB是1986年发现的,从成熟的B淋巴细胞中抽提出的能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的核因子。抑制NF-κB活性可以抑制肿瘤细胞增长、促进细胞凋亡、增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、抑制炎症反应、减少肿瘤血管生成等。作为NF-κB主要发挥转录调节功能的亚基p65,在肿瘤的发生、发展中发挥着关键性作用,下调p65的表达可以抑制多种肿瘤细胞在体内外的增殖及诱导细胞凋亡。因此,p65的靶向治疗可能在乳腺癌的临床治疗中拥有广泛的应用前景。 INK1197浓度 目的:本实验中选取三阴性高侵袭性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为研究对象,通过不同的实验方法探讨celecoxib的抑癌作用,研究celecoxib在三阴性乳腺癌细胞中对NF-κB活性的影响;检测异常活化的NF-κB信号通路在MDA-MB-231细胞增殖、凋亡以及侵袭中发挥的作用;评价celecoxib是否能够成为TNBC个体化治疗的辅助用药,针对NF-κB信号通路的靶向治疗能否使乳腺癌的化学治疗更加完善,最终为预防、治疗TNBC提供新的治疗思路。

方法: 1以不同浓度的celecoxib作用人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,MTT比色法观察其对该细胞增殖的影响,并进一步探讨celecoxib抑制MDA-MB-231细胞的增殖与COX-2途径依赖关系。采用流式细胞仪技术(flow cytometry, FCM)、Hoechst 33258、DNA Ladder形成实验、western blot等方法,研究celecoxib对体外培养的MDA-MB-231细胞凋亡的影响。 2采用伤口愈合实验、transwell侵袭小室实验等,观察celecoxib对MDA-MB-231细胞侵袭行为的影响。并通过RT-PCR法检测肿瘤细胞侵袭转移关键的细胞因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)及IL-8(interleukin-8, IL-8)的表达变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-8的分泌水平。 3为了研究celecoxib的抗凋亡、抑制细胞侵袭作用与NF-κB信号通路的关系,应用western blot方法检测了不同浓度celecoxib作用后MDA-MB-231细胞的p65、p50、IκBα(inhibitory kappaBα,IκBα)以及磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表达情况,并进一步通过western

blot法检测p65的核转位变化。采用凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic 还有 mobility shift assay,EMSA)检测用药前后NF-κB DNA结合活性的改变。 4构建表达p65cDNA的真核表达载体,转染MDA-MB-231细胞,观察过表达p65基因对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,并通过与celecoxib联合作用,揭示celecoxib和NF-κB信号通路之间的联系。 5利用微小RNA(microRNA,miRNA)技术,构建表达p65miRNA的真核表达载体,沉默p65基因的表达,观察NF-κB信号通路阻断对人乳癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡以及侵袭的影响。 结果: 1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞生物学活性的影响 1.1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞增殖的影响 MTT分析结果显示,经celecoxib作用24h、48h和72h后,与溶剂对照组相比,对MDA-MB-231细胞增殖有明显的抑制作用(P0.05)。提示celecoxib不是通过COX-2和PGE2途径来抑制细胞的增殖。 1.2 Celecoxib对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 Celecoxib可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡,使部分细胞出现形态不规则、细胞核固缩聚集、空泡样变性、核碎裂等凋亡的形态学变化。Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察,有些细胞核内可见到有浓染致密的荧光颗粒,细胞核呈碎块状、颜色发白。随着celecoxib浓度的增加,凋亡细胞的比例也在逐渐增加,不同浓度组之间有显著差异(P<0.05),裂解蛋白表达上调(P<0.05)。Celecoxib还可以抑制MDA-MB-231组成性自分泌IL-8(P0.05)。 2.

02版本）以上不良反应及药物相关的死亡病例。治疗过程，总计有11例（24.4%）患者发生3级不良反应，减至50%剂量（400mg,qd）后症状缓解。最常见的不良反应为皮疹，其次为腹泻，第三为手足综合征。根据对意向治疗（ITT）人群进行统计学分析，进入第12周时达到疾病控制的患者为16例，疾病控制率（DCR）为35.5%，以2014年3月12日为研究终点，没有发现完全缓解（CR）病例，1例（2.2%）患者达到部分缓解（PR），15例（33.3%）患者达到疾病稳定（SD）。3例（6.6%）失访，2例（4.4%）因不能耐受药物的副反应而中途退出研究，脱落率为11.1%。24例（53.3%）经影像学证实疾病进展（PD）。其至疾病进展时间（TTP），中位数86天（范围：39-213天），其95%可信区间为（83.02，88.98）（天）。其无进展生存期（PFS），中位数为86天（范围：39-213天），其95%可信区间为（83.02，88.98）（天）。中位生存期（OS）为129天（范围：68-398天），95%可信区间为（117.77，140.23）（天）。中位治疗持续时间（DOT）为86天（范围：9-213天），95%可信区间为（83.92，88.08）（天）。患者入组前采取的外科治疗方式对疾病进展及生存时间有明显的影响，R0术后复发组中位PFS为126天，而姑息活检组为81天（P=0.035）。R0术后复发组中位OS为148天，而姑息活检组为87天（P=0.002）。

此网站 AP24534购买 结论：对45例试验患者数据的统计研究发现，其12周时的DCR达到35.5%，较以往基于5-Fu或吉西他滨化疗方案的研究数据无明显差异，然而其中位TTP和OS并不理想，分别为86天和129天。通过与以往历史数据比较，我们的临床试验研究表明索拉菲尼并未显著改善进展期肝内胆管细胞癌的生存预后，但仍需扩大样本量来进一步证实。在药物的不良反应发生上，与索拉菲尼治疗肝细胞癌及进展期胆道肿瘤（含胆囊癌，肝外胆管癌）所报道并无明显差异[29,40]。我们观察到在整个临床试验过程中，没有发现4级以上不良反应及药物相关的死亡病例。大部分患者经过对症处理后都能缓解。在临床试验过程中，总计有11例（24.4%）患者发生3级不良反应（NCICTCAE4.02版本），其G3发生率相比历史数据低，因此，索拉菲尼在治疗进展期肝内胆管细胞癌的安全性是确切的。
背景及目的： 磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)及蛋白激酶B(AKT)所组成的信号通路与肿瘤增殖、凋亡、转移、侵袭及血管生成密切相关。作为该通路的核心,异常活化的AKT通过磷酸化其下游分子促进肿瘤恶性增殖及抵抗凋亡,并参与调节肿瘤对放化疗及靶向治疗的敏感性。特异性抑制AKT分子活化能有效阻断P13K/AKT信号通路,抑制肿瘤增殖,促进凋亡。研究显示在胃癌内P13K/AKT通路亦处于异常激活状态,活化的AKT不仅与胃癌的分化、淋巴结转移、恶性程度相关,而且促进了胃癌对化疗药物敏感性的降低。MK-2206作为新型的AKT变构抑制剂,能同时抑制AKT三种亚型,其抗肿瘤效果已在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤的体外及体内学实验中得以验证,但关于其在胃癌中的疗效,文献报道不多。 本研究目的是通过体外实验探讨MK-2206对胃癌细胞生长的影响,分析其与胃癌常用化疗药物联用时药物之间的联合效应及增强化疗药物抗肿瘤机制,为临床上联合应用MK-2206治疗胃癌提供实验依据。 方法： 1.不同浓度的MK-2206(0-32μmol/1)作用胃癌SGC-7901及MKN45细胞24,48,72小时。MTS法测定MK-2206对SGC-7901及MKN45细胞的OD490nm值。GraphPad

Prism计算各时间段内药物IC50值。 2.MK-2206与化疗药物多柔比星及5-氟尿嘧啶均以2倍的稀释梯度联合作用于SGC-7901及MKN45细胞72小时,MTS法测定各孔OD490nm值。(GraphPad Prism计算联合组IC50值,利用Chou-Talalay合并指数方法评价MK-2206联合多柔比星或5-氟尿嘧啶对SGC-7901及MKN45生长抑制的联合效应。 3.平板克隆形成实验：1μmol/1MK-2206处理SGC-7901细胞10天,甲醇固定,龙胆紫染色,显微镜下观察计数,计算SGC-7901细胞克隆形成率。 4.不同浓度MK-2206(0-16μmol/l)处理胃癌SGC-7901细胞3h和6h,western ABT-888核磁共振 blot方法分析总AKT及磷酸化AKT表达量。采用1μmol/1MK-2206联合不同浓度多柔比星(0～0.9μmol/l)或5-氟尿嘧啶(0～500μg/m1)处理SGC-7901,western blot检测细胞内AKT信号通路变化及凋亡相关蛋白PARP、cleaved-PARP, caspase3,7,9及cleaved-caspase3,7,9变化。结果： 1.MK-2206能有效抑制胃癌SGC-7901及MKN45细胞生长,但其对SGC-7901细胞的抑制作用于8μmol/1后开始明显,对MKN45细胞的抑制作用于4μmol/1起明显。Graphpad Prism软件计算SGC-7901细胞及MKN45细胞24h药物IC50值分别为23.08及19.85μmol/1;48h IC50值为13.95及13.14μmol/l;72hIC50值为8.870及8.939μmol/l。 2.MK-2206能协同增强多柔比星及5-Fu对胃癌细胞SGC-7901及MKN45生长抑制作用,以对SGC-7901细胞抑制更加显著。计算MK-2206与多柔比星和5-氟尿嘧啶联合处理SGC-7901细胞的联合指数CI分别为0.21和0.25；而对于MKN45细胞,计算联合指数分别为0.60和0.71。 3.平板克隆形成实验显示对照组SGC-7901细胞克隆形成率为38.87+5.9%,1μpmol/1MK-2206组的克隆形成率为18.134±1.8%,两组间差异具有统计学意义(P=0.004)。 4.

靶向Myc基因的miRNAs的预测及验证。Myc在AICAR处理后显著下调。为了探索Myc基因表达下调的原因，我们利用TargetScan和miRanda两个数据库对可能靶向Myc的miRNAs进行了预测，并筛选了其中在AICAR处理后表达上调的miRNAs进行进一步的验证。结果证实miR-34a，34b，34c能够在J1小鼠ES细胞中抑制Myc的表达，而miR-135b和miR-340也可能直接靶向Myc基因mRNA的3非编码区（untranslatedregion，UTR）调控其表达。 总之，本研究表明AICAR的加入利于J1小鼠ES细胞的自我更新和多潜能性的维持，这将为ES细胞在医学上的研究及应用提供一定的理论基础。
人参皂甙Rg3是从人参中提取的中药单体,研究表明人参皂甙Rg3具有抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等作用,Rg3抗肿瘤机理的研究是目前中草药抗肿瘤研究的热点之一。 本研究主要包括： (1)利用MTT法、流式细胞术测定人参皂甙Rg3对人食道癌EC9706细胞的生长抑制作用；采用免疫组化、RT-PCR和Westen-blot等方法分析人参皂甙Rg3对细胞周期蛋白p21、p27、c-Myc、PCNA和Cyclin-D1等表达的影响,探讨人参皂甙Rg3抑制EC9706细胞增殖的分子机制。

(2)采用A O/EB双染色和流式细胞术观察分析Rg3对EC9706细胞凋亡的影响,利用免疫组化、RT-PCR和、Vesten-blot等方法分析人参皂甙Rg3对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-xL、p53、Fas和caspase-3表达的影响,探讨人参皂甙Rg3促EC9706细胞凋亡的分子机制。 (3)采用原代培养的人脐静脉内皮细胞(Human 没有 umbilical vein endothelial cells, HUVECs),利用MTT、流式细胞术、Transwel1小室、小管形成等方法观察Rg3对HUVECs的增殖、迁移、侵袭等方法,研究人参皂苷Rg3体外的抗血管生成作用。 (4)利用免疫细胞化学、RT-PCR、Western-blot等方法,对人参皂甙Rg3作用后EC9706食道癌细胞中血管生成相关分子MMP-2、MMP-9和VEGF的表达进行研究,探讨Rg3对食道癌新生血管抑制的作用机制。 结果显示： (1)50μmol/L人参皂甙Rg3即能抑制食管癌细胞EC9706的增殖,并且有时间和剂量依赖性,人参皂甙Rg3作用后EC9706细胞中G0/G1期细胞数目依浓度递增逐渐增加,而S期和G2/M期细胞数目则依浓度增加而逐渐减少。Rg3作用后,Cyclin-D1和PCNA表达水平皆降低,p21和p27蛋白水平增高,p21蛋白的增高更明显。

(2)200μmol/L、100μimol/L、50μmol/L的Rg3对EC9706细胞凋亡的结果显示,作用48h后EC9706细胞凋亡百分数分别为35.19%,15.48%,8.16%,与对照组相比均有显著性差异,(P
天然免疫系统通过模式识别受体,包括Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)和DNA受体等,识别入侵机体的病原微生物模式相关分子(pathogen-associated NU7441分子重量 molecular pattern, PAMP),经过一系列信号转导,进而启动天然免疫反应。识别PAMP后,这些受体进而活化共同的下游通路激活转录因子包括转录因子NF-κB和IRFs (interferon 确认细节 regulatory factors),进而产生炎性细胞因子以及I型干扰素,进而诱导随后的适应性免疫应答。I型干扰素与其受体相互作用,活化JAK (Janus kinase)和STAT (Signal transducers

and activators of transcription)信号通路,诱导IFN-stimulated genes (ISGs)的表达,这些ISGs协同作用,激活机体的抗病毒反应。尽管,I型干扰素在机体的清除病毒反应中起着非常重要的作用,但是异常的I型干扰素的产生,会引发各种相关免疫疾病。因此,严格的调控I型干扰素对于维持机体的免疫稳态是非常重要的。 去泛素化酶(DUBs)能够从靶蛋白上切除泛素分子或者泛素样分子。已有研究表明,一些DUBs参与调控I型干扰素通路。类如A20、DUBA、泛素特异性蛋白酶17(USP17)、USP4以及USP3等分子通过不同的作用机制调控I型干扰素通路。USP2属于泛素特异性蛋白酶家族,由于剪接方式不同,产生3个剪接体USP2a、USP2b和USP2c。有研究表明USP2a通过靶向TRAF6负向调控IL-1β和病毒诱导的NF-κB活化,然而USP2在I型干扰素通路以及机体抗病毒反应中的作用仍然未知。 因此,本研究从以下几个方面进行。 研究目的： 1.USP2是否参与调控I型干扰素通路,那个剪接体会发挥作用。 2.探讨USP2调控I型干扰素通路的作用机制。 3.USP2是否参与调控其他的天然免疫信号通路。 研究方法： 1.病毒SeV诱导的I型干扰素通路中,USP2表达情况 SeV感染HEK293或THP1细胞不同时间点,Western blot检测USP2蛋白表达。 2.USP2调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达 2.1报告基因方法检测USP2对IFN-β报告基因活化的影响 HEK293细胞转染不同梯度USP2a、USP2b和USP2c表达质粒以及IFN-β-luc报告基因质粒20h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 HEK293细胞转染USP2干扰RNA以及IFN-β-luc报告基因质粒48h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 2.2PCR扩增检测USP2对IFN-β基因表达的调控 HEK293细胞转染USP2a、USP2b和USP2c表达质粒20h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。 HEK293或THP1细胞转染USP2干扰RNA48h后,SeV刺激8h,PCR检测IFN-β基因表达。 3.USP2调控I型干扰素通路的作用机制 3.1确定USP2作用的靶分子 将RLRs信号通路中的接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒共转染到HEK293细胞中,24h后,PCR检测IFN-β基因表达。 HEK293细胞转染接头分子RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1和IRF3-5D以及USP2b质粒和IFN-β-luc报告基因质粒24h后,报告基因检测IFN-β-luc的活化。 3.

05），增加活细胞比率（P<0.05），减少细胞的坏死比率（P<0.05），同时减少KIM-1蛋白的表达量（P<0.05）。加入EPO可以减少HKC细胞在CsA作用下产生KIM-1蛋白（P
研究背景

哪里 转化生长因子-β (TGF-β)在调节心血管生理和疾病中发挥多种作用,而其中重要的作用之一就是调节血管系统中的内皮细胞功能。TGF-β信号通路的失衡会导致胚胎血管发育的异常,而且TGF-β在出生后毛细血管新生中发挥重要的作用。除此之外,研究结果提示TGF-β能调节内皮细胞的增殖,凋亡,通透性变化和形态发生。有证据表明在有心血管疾病危险因素的患者中TGF-β血浆浓度是升高的,这些危险因素包括肥胖和糖尿病。而且,研究检测到患有先兆子痫的女性循环血中TGF-β的水平是升高的。在易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E基因敲除小鼠中,TGF-β表达增加导致内皮细胞氧化应激和内皮功能紊乱。重要的是,TGF-β在内皮细胞中的生物学作用往往是矛盾的(或有保护作用或者是有害的),作用的不同取决于细胞的环境和细胞的类型。 在内皮细胞中, TGF-β发挥作用主要由活化素受体样激酶1(ALK1)和ALK5两种膜受体介导。激活的ALK1受体磷酸化Smadl/5/8,然而ALK5的激活引起Smad2/3的磷酸化。这些活化的Smad蛋白与Smad4结合,作为一个转录激活复合物调节各种各样靶基因的表达,然而ALK1和ALK5的激活可能会引起不同的内皮细胞生物学效应。除这些经典信号途径外,最近研究提示NADPH氧化酶依赖的氧化还原机制或许介导了TGF-β生物学作用的调节。特别是,TGF-β特异性上调多种细胞中Nox4型NADPH氧化酶的表达。更重要的是,这些研究证实阻断Nox4的表达或功能抑制TGF-β对多种细胞功能的影响,提示Nox4在TGF-β信号通路中发挥重要的作用。

多项证据表明TGF-β能引起不同类型内皮细胞的凋亡,然而TGF-β引起凋亡的信号机制还知之甚少。研究证实TGF-β引起肺毛细血管内皮细胞凋亡,这种作用依赖于ALK5-Smad2通路和下调抗凋亡基因Bcl-2和cFLIP。另一方面,多项研究指出p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡。然而,迄今为止鲜有研究表明TGF-β引起的内皮细胞凋亡涉及氧化还原依赖的信号途径。鉴于最近的结果显示活性氧簇(ROS)生成的增加或许在TGF-β引起的内皮细胞的凋亡中有重要作用,我们提出以下假设：Nox4依赖的氧化还原调节途径或许介导了TGF-β引起的内皮细胞的凋亡。 研究目的 1. TGF-β在内皮细胞凋亡中的作用 2.Nox4氧化还原信号通路是否介导了TGF-β引起的内皮细胞凋亡 很少 3.MAPK信号通路在TGF-β引起内皮细胞凋亡中的作用及机制研究 selleck化学药品 研究方法 1.人内皮细胞培养 人脐静脉内皮细胞HUVECs和永生化的人微细血管内皮细胞HMVECs购买自ATCC。细胞在含有5%胎牛血清的完全内皮细胞培养基(ECM)中培养,置于5%CO2,37℃条件的细胞培养箱中。待细胞长至融合时,用胰酶消化细胞进行传代培养,第3到6代之间的HUVECs用于实验。

2.Caspase3/7活性测定 培养在96孔板中的细胞经药物处理后,加入Caspase-Glo3/7试剂检测Caspase3/7活性。样品转移到白色96孔板中,用全波长扫描式多功能读数仪进行读板测定。 3.蛋白质免疫印迹 处理细胞后,用裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。 4. TUNEL法检测细胞凋亡 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)法按照Millipore的步骤进行,其中标记的棕褐色为凋亡细胞的细胞核,绿色为正常细胞。随机取10个视野计数TUNEL阳性的细胞和总细胞数,TUNEL阳性细胞与总细胞的比值作为细胞凋亡率。 5.ROS检测 细胞内的ROS用DCFH-DA荧光染料检测,处理后的细胞加入DCFH-DA在37。C孵育20分钟并用激光共聚焦显微镜拍照留取图片,或者将DCFH-DA孵育的细胞悬液转移到96孔白板中检测荧光强度。 6.线粒体膜电位(△ψm)的检测 荧光探针JC-1用来检测线粒体膜电位的变化。药物处理后的细胞用JC-1进行染色,然后流式细胞术或者激光共聚焦显微镜检测红绿荧光的变化。 7.Nox4干扰试验 从备选的3条Nox4shRNA中挑选出干扰效率最高的一条进行实验,携带有Nox4shRNA和对照shRNA的慢病毒载体由上海吉玛公司构建。其中靶向Nox4的shRNA序列是5′GCTGTATATTGATGGTCCTTT3′,对照shRNA序列为5′GGTGTCTTCGAATTTATGTCT3′。将慢病毒转染细胞48小时后进行后续实验。 8.实时荧光定量PCR检测mRNA水平的表达 TRIzol试剂提取处理细胞的总RNA,逆转录成cDNA,再用Taqman探针-引物体系进行PCR,18S作为管家基因检测：mRNA表达的相对变化。 9.细胞免疫荧光法 培养于Lab-Tek腔室玻片上的细胞固定后,加一抗和荧光二抗孵育,用DAPI复染细胞核,激光共聚焦显微镜拍照。 10.统计学分析 数据用均数±标准误表示,用SPSS18.

6±1.076 %（与对照组比较P
目前，恶性肿瘤依然是威胁人类生命的主要杀手，而且随着抗生素和免疫抑制剂的大量应用等原因，深部真菌感染也逐渐成为许多疾病死亡的原因，所以，世界各国都投入大量的人力、财力，加强对抗肿瘤、抗真菌药物的研究。海洋由于其生态环境和生物多样性与陆地有很大差别，已成为新药开发的宝贵资源；而红树林作为一种特殊的海洋生态环境，是一类尚未很好地开发和利用的微生物资源库和新化合物库。

本文在国家海洋863课题和国家自然科学基金的资助下，以福建省的红树林植物为研究对象，分离红树植物内生真菌，并在菌株鉴定基础上分离纯化其代谢产物，研究化合物的抗菌、抗肿瘤活性，试图为红树植物内生真菌资源的开发和利用提供依据。 我们从福建九龙江口浮宫镇红树植物桐花树树皮分离获得两株内生真菌。经鉴定，HTF3菌株为小穴壳菌属(Dothiorella sp．)，HTF5菌株为小孢盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)，这是首次从红树植物中分离到这两种内生真菌。我们还首次测定了Dothirella sp．的ITS序列并正准备在GenBank中登记注册。 从两个菌株的发酵液中共分离纯化得到10个单体化合物，应用NMR谱和MS谱对化合物进行结构解析，发现从HTF3菌株中分离的5个单体化合物中有4个是未见报道的新结构化合物：2-[3’，5’-二羟基-2’-(7’-羟基)辛酮基苯基]-乙酸乙酯(dothiorelone 一般 A)、2-[3’，5’-二羟基-2’-(6’-羟基)辛酮基苯基]-乙酸乙酯(dothiorelone B)、2-[3’，5’-二羟基-2’-(8’-羟基)辛酮基苯基]-乙酸乙酯(dothiorelone

C)和6，8-二羟基-1(R)(5’-羟己基)-异苯并二氢吡咯-3-酮(dothiorelone D)。另一个虽为已知的cytosporone B(dothiorelone E)，但为我们首次从红树林内生真菌中分离获到。活性检测 一摘要一 中发现5个化合物均表现出不同程度的抗肿瘤活性，其中dothioreloneE活 性最强且有较广的肿瘤谱。这5个化合物均没有抗细菌活性，但dothiorelone E有较强的抗真菌活性，真菌谱较广，且产量达到10mg/L，有作为药物开 发的前景。该成果已申请专利并已公开。本文还分析了类似化合物的结构 与活性的关系，并对可能的作用机理进行了讨论。 从内生真菌HTFS菌株发酵液和菌体中共分离出5个单体化合物，其中 有3个酚类物质，这是首次报道从红树内生真菌代谢物中同时分离到这三 种多酚化合物，推测它们是作为芳香化合物的代谢中间物被分离到的，所 以HTFS菌株可能具有分解芳香化合物的独特能力。从菌体中分离到的2个 脂类物质可能是组成细胞膜的成分。 本文的研究结果表明，红树林内生真菌确是一类值得更好地开发的真 菌资源，是新颖结构和新生理活性的次级代谢产物的一个重要来源。
第一章 地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡体外模型建立及形态学研究 目的：建立地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡体外模型并且进行凋亡形态学研究。方法：以地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型，通过流式细胞术、电镜和荧光显微镜测定模型的稳定性。结果：仅在完全RMPI 并且 1640培养基培养条件下小鼠胸腺细胞自发凋亡百分率为(2.90±0.62)％，在2.5 μmol／L DEX诱导下，3小时培养组(12.70±2.44)％、6小时培养组(53.55±4.59)％发生了细胞凋亡；在1μmol／L DEX诱导下，小鼠胸腺细胞在3h、5h和7h凋亡比率分别为(18.43±0.30)％、(37.85±1.46)％和(62.53±1.81)％，对照组分别为(4.05±0.29)％、(4.81±0.24)％和(7.77±0.31)％，组间差异显著(p＜0.01)；相同时点下，DEX组坏死比率分别为(1.20±0.08)％、(3.99±0.31)％和(6.46±0.81)％，对照组分别为(0.93±0.10)％、(1.27±0.22)％和(1.55±0.19)％，组间差异显著(p＜0.01)。形态学和荧光显微观察到典型的细胞凋亡现象。结论：建立了体外DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡定量模型，并且发现影响模型稳定性的主要因素包括实验动物、温度、机械损伤和操作时间等。

selleck 第二章 地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中MAPK相关信息通路研究 目的：研究在DEX影响小鼠胸腺细胞MAPK相关信号变化特点，以进一步探讨DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中的作用机制。 方法：分别用终浓度为10、25和50μmol／L的ERK1／2特异性阻断剂PD98059(PD)以及10μmol／L的p38特异性阻断剂SB203580(SB)单独和联合1μmol／L的DEX作用小鼠胸腺细胞，并通过Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术测定3 h、5 h和7 h凋亡和坏死细胞比率；以终浓度1μmol／L的DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡，利用SDS-PAGE及Western blot检测0、30、60和180 min细胞内ERK1／2、p38、JNK1／2、c-Myc和caspase-3信号变化特点。 结果：分别在终浓度10、25和50μmol／L的PD单独刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡比例在3、5和7 h时点均显著高于对照组(p＜0.01)，而且表现出PD剂量依赖型诱导小鼠胸腺细胞凋亡趋势；各组坏死比例均高于对照组。 在终浓度10、25和50μmol／L PD和1μmol／L DEX联合刺激下，小鼠胸腺 细胞凋亡坏死进程明显提高，结果显示PD加速DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡。 SB10林mol/L单独刺激下，小鼠胸腺细胞凋亡比例在3、5和7h时点均显 著高于对照组(p0.05)，而从sh (660.91土72.95)开始显著低于对照组(P0.05)。而在11、24和27 h，对照组△wm分别为(256.41士21.59)、(214.14士23.21)和(146.14士17.

014 μM)和化合物1-4m (IC50:0.046μM)具有较强的PI3Ka抑制活性,并且对其具有一定的选择性。对化合物1-41进行分子对接,其与蛋白(PDB:3HHM)结合模式与文献报道的Wortmannin与蛋白的结合模式相似(Fig.1)。这一结果证实以香豆素[4,3-c]并吡唑为骨架设计PI3K抑制剂的可行性。Fig.1化合物1-41和Wortmannin分别与蛋白PI3Ka的对接模式在上述实验结果基础上,基于片段药物设计原理,利用计算机辅助药物设计方法,通过Discovery 很少 Studio软件将上述活性化合物与PI3Ka蛋白活性位点进行了对接,利用对接得到的分子与蛋白的结合方式,及蛋白活性位点结构特征及空间大小及氮取代基的性质,进一步设计并合成了一系列含有哌嗪以及磺酰基片段的香豆素[4,3-c]并吡唑衍生物,一共分为三个系列共69个化合物。体外细胞抗肿瘤活性测试的结果表明,大部分化合物显示出了优于阳性对照药的抗肿瘤细胞增殖活性。部分化合物表现出很好的对PI3Ka的抑制活性。构效关系及分子对接结果表明：香豆素[4,3-c]并吡唑环氮上取代基的空间位阻及疏水性的大小程度影响了化合物的活性大小,取代基的空间位阻越大,疏水性越好,化合物的活性越好；无论是含哌嗪等氮杂环的化合物还是含磺酰基哌嗪的化合物,取代基上含芳香结构的化合物活性要比含烷基结构的活性要好,当芳香环上的取代基的位阻越大时,化合物的活性越好,而且对PI3Ka具有明显的选择性,如化合物2-4o(ICso:0.021μM),3-4p

(IC50:0.012 pM),4-7m (IC50:0.009μM),以上结果表明这些化合物是有潜力的PI3Ka抑制剂。此外,我们根据上述结论,在吡唑环上用乙酰基链接一些疏水性和空间位阻比较大的苯基哌嗪,二苯甲基哌嗪和吗啉,哌啶等氮杂环的化合物,一共设计了19个香豆素[4,3-c]并吡唑衍生物。体外抗肿瘤活性测试结果表明,乙酰基上链接二苯甲基哌嗪等位阻较大的基团时,化合物也具有明显的抗细胞增殖活性,同时表现出强的PI3Ka抑制活性,如化合物5-7p

Inhibitor Library cell assay (ICso:0.074μM)和5-7q(IC50：0.016μM)。该研究为香豆素[4,3-c]并吡唑类PI3K抑制剂的研发提供了新的思路。
背景:皮肤中KC的凋亡异常与许多皮肤病如银屑病、扁平苔藓、湿疹、白癜风、皮肤老化和皮肤癌等密切相关。KC的凋亡易受环境因素的影响,其中中波紫外线(UVB)辐射尤为重要。UVB辐射易导致皮肤日晒伤,而慢性长期的辐射则可以导致皮肤光老化甚至皮肤癌的发生,这一过程中KC凋亡异常是其重要的病理生理基础。近年研究发现UVB体内外都可激活KC的抗凋亡信号分子磷酸肌醇3激酶(PI3K)和Akt。UVB诱导KC凋亡过程中,胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的活化可以保护UVB诱导的凋亡,并且IGF-1R缺失可加快UVB诱导的KC凋亡,证实UVB可以活化IGF-1R、促进抗凋亡的作用。上述研究证实UVB诱导KC凋亡的过程中存在KC的自身抗凋亡作用,但其具体机制仍未明确。 目的:通过建立体外UVB照射HaCaT的模型,检测Akt/mTOR通路中p-EGFR、p-Akt、p-S6、p-S6K、p-4EBP1的水平变化,并且检测该通路活化对HaCaT凋亡的影响,旨在探明UVB对Akt/mTOR通路的影响,以及该通路活化在KC抗凋亡中的作用。阐明UVB诱导KC凋亡和抗凋亡的分子机制,更加全面准确理解UVB对KC作用的机制,为阐明KC凋亡异常密切相关的皮肤病如白癜风、皮肤老化和皮肤癌的分子作用机理,并为这些疾病的预防和治疗提供全新的思路和手段。方法:Western blotting测定Akt/mTOR通路信号分子的动态水平变化,免疫荧光Hoechst

确认细节 33342染色检测细胞凋亡率。 结果:1.UVB可以激活HaCaT细胞Akt/mTOR通路,并在一定范围内(5mJ/cm2～30mJ/cm2)呈剂量依赖性,在一定范围内(5min～30min)呈时间依赖性。2.EGFR抑制剂PD153035预处理显著抑制了UVB诱导的p-EGFR(1068)水平增加,同时也显著抑制了UVB诱导的p-Akt(Ser473、T308)、p-S6 (S235/236)水平增加。3.PI3K抑制剂LY 294002预处理能显著抑制UVB诱导的p-Akt(Ser473)水平增加,同时也能抑制UVB诱导的p-4EBP1(S65)、p-S6(S235/236)、p-S6K(S235/236)水平增加。4.雷帕霉素预处理对p-AKT(Ser473)的水平无影响(P>0.05),但能显著抑制UVB诱导的p-4EBP1(S65)、p-S6(S235/236)、p-S6K(S235/236)水平增加。5.PI3K抑制剂LY 294002和mTOR抑制剂雷帕霉素预处理能增强UVB诱导HaCaT细胞的凋亡作用。 结论:Akt/mTOR通路活化抗UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
恶性肿瘤严重威胁着人们的健康,其死亡率目前居于首位,对肿瘤的预防与治疗一直是医药领域研究的重点和难点。 近年来研究表明,从天然产物中发现新药是抗肿瘤药物研发的重要方式。从传统中草药牡荆属植物黄荆子中提取得到的天然产物VBE含有苯基氢化萘的母核结构,并具有较好的抑制肿瘤生长的作用,经初步研究发现该类化合物的抗肿瘤作用与抑制PI3K-Akt-mTOR信号转导通路有关。 由于从天然植物中提取困难,来源有限,且全合成难度大,收率低,于是本课题以从黄荆中提取分离的具有抗肿瘤活性的天然产物VBE-1为先导化合物,对其结构进行改造,设计合成了8个苯基氢化萘类衍生物,完成了目标化合物的结构确证,并采用MTT法和SRB法对这些化合物抗白血病HL-60细胞和肺癌A459细胞活性做了初步筛选,发现化合物Ⅵ对白血病HL-60细胞抑制活性较好。同时对苯基氢化萘类化合物抗肿瘤活性的构效关系进行了初步探讨,芳环上以7位,3’位甲氧基,6位,4’位羟基取代活性最高。 本课题研究为设计开发活性更好的新型苯基氢化萘类抗肿瘤化合物奠定了基础。
VBE-1为中药黄荆子Vitex Negundo L.

05);但与Control组相比,HMGB1-100μg组心肌梗死面积显著增大(56.4±5.1% vs. 44.6±3.7%,P0.05)。 结论40mg/kg的EP是治疗大鼠心肌缺血-再灌注损伤的最佳剂量;缺血前预先应用EP的疗效优于再灌注即刻给药,当给药时间延迟到再灌注后30分钟则EP的心肌保护作用消失;缺血前2分钟至再灌注前2分钟是EP保护心肌缺血-再灌注损伤的最佳时间窗。

三、HMGB1介导炎性缺血-再灌注损伤的机制及EP的作用 目的观察丙酮酸乙酯(EP)干预对炎症因子表达及炎症性心肌缺血-再灌注损伤的影响;研究EP干预对心肌缺血-再灌注后炎症因子表达变化的调控机制。 方法清洁级健康雄性SD大鼠分为4组,每组12只,均给予缺血30分钟,再灌注48小时:1.假手术组(Sham),只穿线不结扎;2.对照组(Control),于再灌注前给予PBS Selleck GSK1120212 0.5ml+RLS 0.5ml静脉注射;3. EP治疗组(EP),再灌注前2分钟给予静脉注射EP(40mg/kg);4. EP+HMGB1组(EP+HMGB1):缺血再灌注前2分钟静脉注射EP(40mg/kg)+重组HMGB1(100μg /kg)。采用有创血流动力学检测大鼠左心功能变化,TTC染色计算心肌梗死面积,ELISA法检测血清HMGB1、TNF-α、IL-6,Western Blot检测心肌磷酸化P38的表达。 结果与Sham组相比,Control组心肌梗死面积显著增加,心功能显著恶化,血清HMGB1、TNF-α、IL-6表达显著增高,磷酸化P38水平显著增高(P
目的：本研究观察慢性应激的主要神经递质儿茶酚胺(Catecholamines, CAs)对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cells, MoDCs)迁移功能以及趋化因子受体(Chemokine Receptor-7, CCR7)表达的影响,并进一步研究肾上腺素受体(adrenergic receptors, AR)-丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)-核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路在其中起的作用。方法：磁珠分选法纯化人外周血单核细胞,经rhGM-CSF和rh-IL4诱导分化为不成熟DCs。LPS诱导成熟的基础上给予不同浓度肾上腺素或去甲肾上腺素刺激,采用transwell小室检测DCs向MIP-3迁移能力,流式细胞仪及荧光定量逆转录多聚酶链反应检测CCR7基因和蛋白的表达,ELISA检测细胞因子IL10分泌的变化,Western-blot观察p38

MAPK及NF-κB通路的蛋白表达变化情况。进一步通过给予α、β1、β2、β等不同肾上腺素受体阻滞剂,以及MAPK、NF-κB等通路抑制剂,研究肾上腺素受体和信号通路在其中的作用。 结果：肾上腺素和去甲肾上腺素不影响DCs的凋亡和成熟(CD86,HLA-DR),但均可抑制LPS诱导成熟的DCs向MIP-3β迁移(p
镍(Nickel)是人类在生产和生活中广泛接触的一种金属元素。常接触镍的职业包括：镍的冶炼、提纯、电镀、制造不锈钢以及生产镍铬电池等。人群流行病学调查和动物实验均已证实镍的职业性接触可以引起癌症,主要是肺癌,国际癌症研究中心(IARC)1990年将镍及其化合物列为第一类致癌物,其中尤以镍尘NiS和Ni3S2致癌性最强,其次为Ni2O3。目前有关镍致癌机理的研究主要集中在四个方面：一是镍诱导ras、P53等基因突变的形成,继而导致癌相关基因表达异常,诱发肿瘤的形成；二是镍诱导细胞内信号转导的改变,引起转录因子的异常活化并导致基因表达谱的改变,继而导致肿瘤的形成；三是镍诱导细胞产生的氧自由基可以导致细胞内遗传物质的损伤,影响癌相关基因的表达,最终导致肿瘤的发生；四是镍除了直接诱导基因组的表达之外,还可通过表观遗传学的改变,继而影响癌相关基因的表达,促进肿瘤的发生。目前有关镍诱导肿瘤发生以及肺损伤的研究很多,但是由于镍在人体中代谢的复杂性,镍致癌的分子机制到目前为止并未完全阐明,因此本文将镍化物诱导活性氧产生、激活信号转导通路、诱导细胞中核转录因子的活性以及中医药的干预实验对镍致癌的分子机制进行初步探讨,试图为镍致职业性肺癌的预防和中药治疗予以理论上的探索。 确认细节 方法 1.体外培养支气管上皮细胞(16HBE),分别用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-8.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+扶正解毒(FJD)含药血清(低、中、高剂量组、空白血清组)处理细胞24h,用台盼蓝法检测支气管上皮细胞的存活率。取对数生长期的16HBE细胞接种于24孔培养板内,6×106个／孔,每个剂量设5个复孔,按实验分组分别加入受试物,继续培养24h,各组细胞弃去上清液,每孔加入500μl细胞裂解液,冰上放置30min,将裂解液作用后的各组细胞转移至Eppendorf管,离心20min,取上清液进行谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)活性检测。将受试物处理后的各组细胞以PBS反复洗涤细胞,直至显微镜下大部分细胞已超声破碎,进行超氧化歧化酶(SOD)活性的检测。用考马斯亮兰蛋白测定法,用分光光度计测定波长595nm处吸光度OD值,计算蛋白含量,结合蛋白浓度计算16HBE细胞(细胞处理方法同前)内丙二醛(MDA)含量。2.将16HBE细胞接种于25ml培养瓶中,每孔接种的细胞数为6×106,培养24h后,用NiS

而且 (1-5.0μmol/L)染毒,并用无菌的MEM、NiS (2.0μmol/L)+不同剂量FJD含药血清、空白血清、以及三种抑制剂,磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)处理细胞24h,无菌PBS洗涤细胞2次,胰酶消化后制成细胞悬液,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(Western blot)法观察各组细胞中磷酸化ERK、P38和JNK的表达。3.将16HBE细胞用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-4.0μmol/L)、NiS (2.

05。Rapamycin组中,神经元中和胶质细胞的自噬的表达在4h、1d、3d、7d和21d逐渐升高,较单纯的脊髓损伤组有所提高,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,Bcl-2的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所升高,且差异具有统计学意义,P<0.05。经过Western检测,我们发现单纯的脊髓损伤组各个时间点的BAX的表达较正常对照组均有所下降。3-MA组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所上升,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。结论脊髓损伤后,自噬的抑制能够诱发神经元和胶质细胞的凋亡,自噬的增强能够抑制神经元和胶质细胞的凋亡；自噬的抑制能够抑制Bcl-2的表达,促进BAX的表达,自噬的增强能够促进Bcl-2的表达,抑制BAX的表达。
成人原发性中枢神经系统肿瘤中，包括多种组织学类型的脑神经胶质瘤是最为多见的。而恶性级别最高的要数胶质母细胞瘤，GBM的标准治疗包括早期肿瘤的手术切除、口服烷化剂替莫唑胺（TMZ）化疗及辅助性放疗结合。不过，由于这些肿瘤令人难以置信的耐药和肿瘤频繁复发，胶质母细胞瘤对外科手术治疗、放化疗极其耐受，GBM的中位生存时间仅限于诊断后约15个月。除了肿瘤细胞自身对放疗、化疗的抵制，肿瘤与内环境之间的相互作用还通过参与肿瘤的抗血管生成、组织缺氧和免疫抑制。化疗药物在恶性胶质瘤的治疗中发挥重要作用。新一代烷化剂替莫唑胺是目前对恶性胶质瘤的标准化疗药物，并已被证明有着良好的临床治疗效果。替莫唑胺是经过O6-G甲基化诱导的引发DNA损伤激活的错配修复机制，然而，由于化疗药物内在性和获得性耐药现象还有血脑屏障的存在，很大程度上影响了化疗效果。

MEK inhibitor AKT作为PI3K/AKT传导途径中的关键因子，在促成肿瘤细胞生长增殖、血管的生成、增加侵袭转移的发生、抑制肿瘤的凋亡和抵制放化疗中起着非常关键的作用。大量文献报导AKT在肿瘤的发生发展及转移中扮演了重要角色，更深入的研究AKT作用的分子生物学机理并发现其与恶性癌症的相关性，有可能为癌症的基因治疗、抗肿瘤药物的开发研究提供新的思路和作用靶点。我科前期实验通过GBM基因芯片研究发现了29条基因和替莫唑胺化疗耐药相关且影响患者生存期，AKT2基因就是其中一个。近年来，一些实验研究已经表明PI3K/AKT信号传导途径与癌症化疗疗效关系比较密切。AKT活化还可能参与肿瘤放射治疗的抵抗，研究结果表明AKT2似乎是一个有效的克服胶质瘤治疗抵抗重要靶标。根据既往实验结果我们初步推测沉默AKT2基因表达可能成为临床上增加胶质瘤化疗敏感性的一种可行性的方法。本实验将分四部分研究AKT2基因沉默在胶质母细胞瘤中对替莫唑胺化疗疗效的改变及其作用机理。第一部分，RNA沉默AKT2的表达对胶质瘤U251细胞株替莫唑胺疗效的影响；第二部分，RNA沉默AKT2的表达对胶质瘤裸鼠移植瘤的替莫唑胺疗效的影响；第三部分，胶质瘤替莫唑胺化疗耐药细胞株的建立及其特性鉴定；第四部分，AKT2在胶质瘤细胞中替莫唑胺化疗抵制的作用机理研究。通过以上实验阐明AKT2基因在脑胶质瘤莫唑胺化疗耐药中的分子生物学机制，在分子水平上寻找和莫唑胺化疗耐药相关的关键基因及其作用机制，提高临床上脑胶质瘤患者对替莫唑胺的化疗敏感性。 DAPT secretase制造商 第一部分RNA干扰AKT2的表达对胶质瘤U251细胞株替莫唑胺敏感性的影响目的：研究胶质母细胞瘤U251细胞中AKT2基因沉默对替莫唑胺化疗效果的改变。方法：AKT2基因慢病毒载体的构建，然后在体外条件下将AKT2特异性shRNA表达载体AKT2-shRNA转染至U251细胞株中。蛋白印迹、Real-time

PCR实验方法测定转染shRNA后U251细胞中AKT2基因表达水平的变化，应用CCK8法检测RNA干扰AKT2后U251细胞对替莫唑胺敏感性的变化情况。 结果：转染AKT2-shRNA后U251细胞AKT2基因表达程度较U251未转染组和U251转染阴性慢病毒组都显著下降；替莫唑胺对U251细胞的半数细胞抑制浓度（IC50）从U251空白对照组的(39.72±2.41)μg/ml、阴性对照组的(39.43±2.24)μg/ml降到(27.23±1.93)μg/ml，AKT2干扰组U251细胞对TMZ药物的疗效变化有显著性差异（P＜0.05）。 此网站 结论：AKT2-shRNA能够抑制胶质母细胞瘤细胞株U251中AKT2表达，并能增加对替莫唑胺的敏感性。 第二部分RNA干扰AKT2表达对胶质瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺敏感性的影响 目的：研究RNA沉默AKT2对脑胶质瘤移植瘤的替莫唑胺疗效的改变。 方法：首先，构建胶质瘤裸鼠成瘤模型，瘤内注射和腹腔内给TMZ药物，以替莫唑胺化疗药物和AKT2-shRNA表达载体对成瘤后的裸鼠瘤体进行联合干预治疗，进而观察并测量各组裸鼠肿瘤体积大小。Real-time PCR及免疫组化实验分别测定各组裸鼠肿瘤细胞的AKT2的表达程度， TUNEL实验测定并计算分析各组裸鼠成瘤后肿瘤组织细胞的凋亡的变化。 结果：空白对照组、替莫唑胺化疗组、TMZ+阴性对照组、TMZ+AKT2干扰组裸鼠瘤体体积分别为：(669.34±98.73) mm3、(399.86±55.26) mm3、(383.81±34.01) mm3、(297.72±41.49) mm3；瘤体质量分别为：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干扰组其肿瘤体积及瘤体质量都明显小于空白对照组、替莫唑胺组和TMZ+阴性对照组，有显著性差异（P＜0.05）。免疫组化和Real-time PCR实验表明TMZ+AKT2干扰组比其他对照组AKT2表达程度显著降低（P＜0.

55%。并且几乎不会对荷瘤小鼠的一般状态及肝、肺、肾等主要脏器产生不良影响。进一步研究发现,ARG在体内抑制肿瘤组织的生长是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。其主要作用机制是通过上调p-JNK、p-p38、Bax以及TNF-α的表达介导细胞凋亡的发生。ARG体内抗肿瘤研究说明ARG不仅可以抑制肿瘤的生长,同时具有低毒的作用特点,此研究结果为ARG的进一步开发奠定了试验基础。综上所述,本研究发明建立了一种简便高效的ARG提取方法,适合于实验室自行提取制备ARG,并且此方法具有成本低廉、提取纯度高、污染少等诸多优点。在此基础之上,本研究对ARG的抗肿瘤作用及其体内外作用机制进行了深入探索。研究结果表明,ARG在体内外均具有良好的抗肿瘤作用,其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,研究还发现ARG在体外几乎不会对正常组织细胞产生抑制作用,且在动物体内具有低毒的作用特点。由此可见,ARG是一种极具开发潜力的抗肿瘤化合物,本项研究为ARG的进一步开发利用奠定了试验基础。
背景与目的糖尿病视网膜病变(Diabetic

寻找更多 retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并发症,也被认为是一种慢性低度炎症性疾病。在糖尿病的早期阶段,DR的特征是视网膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破坏,而组成内层视网膜屏障的主要部分是内皮细胞,并且随着糖尿病病程的延长,内皮细胞死亡数目增加。除内皮细胞死亡外,炎症介质也会通过激活细胞内信号增加血管通透性。炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和动物模型的视网膜、玻璃体和血清中升高,还能以旁分泌和自分泌的方式诱导自身的合成,加速并扩大糖尿病视网膜中的炎症级联反应。叉头状转录因子O1(Forkhead PFTα溶解度 transcription factor,Fox O1)是叉头状转录因子O亚家族中重要的一员,在调控增殖凋亡、氧化应激、调节自噬和分化等方面发挥重要作用。研究发现,在1型和2型糖尿病大鼠模型的视网膜中,Fox O1的活性增加,并伴随着炎症反应和凋亡增加。因此推测DR状态下Fox O1活性增加可能与炎症有一定的联系,但Fox

O1调节内皮细胞功能的具体机制尚不清楚。研究发现,在原代大鼠肝细胞和HEK293细胞中,IL-1β通过刺激IL-1受体过表达导致胞质和核内Fox O1蛋白量增加。而在巨噬细胞中,Fox O1直接结合到IL-1β启动子上,促进IL-1β的表达增加。因此推测,IL-1β在视网膜内皮细胞中可刺激Fox O1表达增加,从而促进IL-1β的表达增加。本实验以Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体下调内皮细胞和STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中的Fox O1的表达及活性,观察Fox O1在IL-1β诱导的自刺激中的作用,并探讨其机制。方法原代人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)培养于不同糖浓度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,实时荧光定量PCR(Real-time

PCR)和Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。HRMECs培养于重组人白介素-1β(r IL-1β)的不同浓度(0、1、2.5、10、25、100ng/m L)24h后,Real-time PCR、Western blotting检测处理后细胞的Fox O1、IL-1β、Caspase-8表达,细胞免疫荧光检测处理后细胞中Fox O1的表达分布,流式细胞仪检测不同浓度r IL-1β处理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培养于IL-1受体阻断剂(IL-1RA)、MAPK阻断剂(U0126、SB203580、SP600125)中伴或不伴r 购买RAD001 IL-1β(10ng/m L),Western blotting法检测Fox O1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表达。将构建的Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)转染于正常培养的HRMECs,转染后的细胞经或不经过r IL-1β(10ng/m L)刺激24h后,Real-time PCR、Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。40只SPF级雄性SD大鼠,随机选取其中30只构建糖尿病大鼠模型,10只作为正常对照组(NC组)。糖尿病造模成功后,将成模糖尿病大鼠随机分为3组:糖尿病组(DM组),糖尿病Fox O1干扰转染组(LV-si-Fox O1组)和糖尿病空病毒转染组(LV-NC组)。大鼠麻醉后,在解剖显微镜下玻璃体注射Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)10μl,涂抹抗生素软膏以保护角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末,称体重(Body Weight,BW),尾静脉取血测血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠,迅速剥离出眼球,置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫组化检查,于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查。新鲜眼球,去除眼前节,分离出视网膜,迅速于液氮中冷冻,荧光定量PCR和Western bloting检测Fox O1、IL-1β表达。结果1.高糖诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达增加:Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA的表达水平随着葡萄糖浓度的增加而增加,特别是糖浓度在35mmol/L时候显著升高(P0.05)。3.