25(OH)2D3诱导SW1353后， p-ERK1/2水平显著高于正常组，而p-p38和p-JNK低于正常组，差异具有统计学意义（p0.05）。qRT-PCR和ELISA法结果显示IL-1β诱导SW1353后，OPG、RANKL、RANK mRNA和蛋白的表达和OPG/RANKL比值高于正常组。SB203580组OPG mRNA、蛋白水平和OPG/RANKL比值低于模型组，而RANK mRNA、RANKLmRNA和蛋白量高于模型组；PD98059组OPG/RANKL比值高于模型组，差异具有统计学意义（p0.05）；SP600125组RANKL、OPG mRNA和蛋白、RANK

mRNA表达明显低于模型组，OPG/RANKL比值高于模型组，差异具有统计学意义（p0.05）。 结论：MAPKs通路可调节OA软骨细胞OPG、RANKL、RANK的水平。 第二部分：OPG对人软骨细胞增殖和凋亡影响的实验研究 目的：明确OPG对软骨细胞的作用及机制。 方法：予以不同浓度的重组人OPG-Fc作用于SW1353，MTT法检测细胞生存率，并筛选OPG-Fc的最佳作用浓度和时间纳入后续试验。以SW1353为研究对象，分为7组。分别以OPG-Fc、SB203580和PD980959对SW1353进行干预。Western 一般 blot法检测p-p38、p-ERK1/2蛋白的表达。qRT-PCR法检测Bax、Bcl-2和caspase3mRNA的表达。流式细胞术检测细胞周期。 或者 结果：MTT结果提示:25ng/ml、50ng/ml的OPG-Fc能够促进SW1353细胞增殖，且50ng/ml组优于25ng/ml组。而100ng/mlOPG促进细胞凋亡。其中以72h作用显著。Western blot法结果显示，OPG-Fc诱导SW1353后，50ng/mlOPG-Fc组p-p38蛋白水平低于正常组，p-ERK1/2蛋白水平高于正常组，而100ng/ml组p-p38表达高于正常组，p-ERK1/2低于正常组。qRT-PCR法结果显示，50ng/mlOPG-Fc组Bax、caspase3mRNA和Bax/Bcl-2比值水平低于正常组，Bcl-2mRNA水平高于正常组，可被PD98059抑制；100ng/mlOPG-Fc组Bax、caspase3mRNA和Bax/Bcl-2比值水平高于正常组，而Bcl-2mRNA表达低于正常组，可被SB203580拮抗。流式细胞结果显示50ng/mlOPG-Fc组细胞增殖指数（PI）高于正常组，可被PD98059抑制；100ng/mlOPG-Fc组PI低于正常组，可被SB203580拮抗，差异具有统计学意义(p
卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,早期诊断困难,病理类型复杂多样,预后较差。虽经积极手术及术后化疗,五年生存率仍徘徊在40%左右。为了探寻卵巢癌治疗新靶点,我们在前期研究的基础上阐明了PAF/PAFR信号通路在卵巢癌侵袭中的作用及机制,观察了PAFR阻断剂银杏内酯B(GB)对裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用,并初步探讨了GB降低携带BRCA1突变卵巢上皮细胞癌变风险的相关机制,研究分以下三部分：

Selleck GSI-IX 第一部分PAF促进卵巢癌细胞侵袭的相关机制 目的探讨PAF对PAFR阳性卵巢癌细胞侵袭的影响及其相关机制。 方法(1)以不同浓度的PAF处理OVCA429细胞6h后检测环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)蛋白的表达水平,处理24h后检测基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达水平；以100nM PAF处理OVCA432, ES-2,SKOV3-luc及RMUG-L细胞各6h,检测p-CREB变化以100nmol/L的PAF处理OVCA429细胞不同时间后检测有丝分裂原活化蛋白激酶p38蛋白(p38MAPK).磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK). CREB及p-CREB蛋白的表达水平,上述各蛋白的表达水平均采用WesternBlot法检测。(2)在加入PAF (100nM)的基础上,分别加入各蛋白抑制剂,即PAFR抑制剂–GB (100μM)、p-p38MAPK抑制剂—SB203580(10μM)、CREB结合蛋白(CBP)-CREB相互作用抑制剂—217505(25gM)。实验分为6组：PAF组.PAF+GB组.PAF+SB203580组、PAF+217505组、PAF+SB203580+217505组及空白对照组,采用Western Blot法检测各组细胞中p-p38MAPK、p-CREB、MMP2蛋白的表达强度。(3)Transwell法检测上述6组处理细胞的侵袭能力。 结果(1)不同浓度的PAF处理后,OVCA429细胞中p-CREB、MMP2蛋白的表达水平呈明显的浓度依赖性(P0.05)。在OVCA432、ES-2及SKOV3-luc中可见到类似结果,但在RMUG-L细胞中未检测到p-CREB的变化。在100nmol/L的PAF处理不同时间后,OVCA429细胞中p38MAPK, CREB蛋白表达水平与无明显变化(P>0.05)；而p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达水平明显升高趋势(P0.05),均显著低于DMSO组(P<0.

7细胞分化成为成熟的破骨细胞。而且鹿角盘提取物可剂量依赖性地减少破骨细胞的数量,降低破骨细胞中TRAP的活性,从而抑制了RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞。LDH活性检验、PI染色和DNA碎片定量分析结果一致表明,鹿角盘提取物是通过诱导成熟的破骨细胞发生凋亡而抑制其活性。而且,RT-PCR检测结果表明鹿角盘提取物是通过下调破骨细胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9mRNA的表达,来抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,从而起防治骨质疏松症的作用。 (4)采用p38特异性抑制剂SB203580干预处理MG-63成骨细胞,进一步验证鹿角盘提取物的抗骨质疏松作用机制。 用p38特异性抑制剂SB203580干预处理成骨细胞,然后采用MTT法、ALP法、茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测分别评价SB203580对成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响。结果表明,SB203580可以有效地阻断鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化骨基质形成的促进作用。而且,用ELISA法和RT-PCR检测OPG和RANKL蛋白含量和基因的表达,结果显示鹿角盘提取物上调了OPG蛋白和mRNA的表达,下调了RANKL蛋白和mRNA的表达,且通过调控成骨细胞中OPG和RANKL的表达,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻断鹿角盘提取物对破骨细胞的抑制作用,提示鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路,双向影响成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡,从而起抗骨质疏松的作用。

综上所述,本研究证实了鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路来促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收,从而起抗骨质疏松的作用,为鹿角盘用于治疗骨质疏松症提供了理论依据。
目的：基于“肾主骨”理论，探讨补肾滋阴代表方剂左归丸促进骨形成作用，及JNK、p38/Smads信号级联对其影响，以探讨左归丸潜在促进骨形成的作用机制。 Selleckchem GDC941 无 材料与方法：采用血清药理学方法，将SPF级SD雌性大鼠60只（180~220g）按体质量随机分为空白对照组、左归丸组和倍美力组，每组各20只，依据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸等临床剂量为1.6g·Kg-1，大鼠倍美力结合雌激素片的等临床剂量为56.25μg·kg-1，使用前用蒸馏水将药物制成混悬液，空白对照组给予蒸馏水，灌服10ml·Kg-1体质量，2次·d-1，连续灌胃7d，末次给药2h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2h，2500r·min-1，4℃离心20min，收集上清，同组血清混匀，56℃水浴灭活30min，制备大鼠含药血清。采用MC3T3-E1成骨细胞系体外研究模型，用含10%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素）培养。细胞实验分为空白对照组（control）、SP600125组（SP）、SB203580组（SB）、左归丸组（ZG）、左归丸+SP600125组（ZG+SP）、左归丸+SB203580组（ZG+SB）、倍美力组（BML）、倍美力+SP600125组（BML+SP）、倍美力+SB203580组（BML+SB）。细胞接种24h后，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素），饥饿24h，吸弃旧培养液，加入含或不含JNK、p38MAPK特异抑制剂SP600125、SB203580(10μmol·L-1，溶于DMSO，体积分数0.05），但显著抑制了ZG诱导7d的ALP活性。

1.3JNK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞矿化作用的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d的矿化作用；加入SP600125后，显著抑制ZG和BML对矿化作用的诱导。 1.4JNK信号通路对左归丸含药血清干预Runx2和ALP蛋白表达的影响 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞48h的Runx2和ALP蛋白的表达；加入SP600125后，未能对抗ZG诱导48h的Runx2和ALP蛋白表达，也未能对抗BML诱导的Runx2蛋白的表达，但显著抑制了BML诱导的ALP蛋白表达。 2.p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞分化的调控 2.1左归丸含药血清能够诱导MC3T3-E1细胞p38MAPK信号通路活化 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞p38磷酸化蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对p38蛋白磷酸化的诱导作用。

Fulvestrant购买 2.2p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化不同阶段ALP活性的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞48h和7d的ALP活性（P＜0.01）；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对48h和7d的ALP活性的刺激作用（P＜0.01）。 2.3p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞14d矿化作用的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d矿化作用；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对细胞矿化的诱导作用。 2.4左归丸含药血清通过p38MAPK信号通路的活化上调Runx2蛋白的表达 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞Runx2蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对Runx2蛋白表达的诱导。 3.JNK、p38MAPK/Smads信号级联参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞功能的调控 3.1左归丸含药血清上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA表达 结果显示，与control组比较，ZG组和BML均组能显著上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA的表达（P＜0.01）。 3.2左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表达 结果显示，与control组比较，ZG组和BML组均能显著诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和p38蛋白的表达；ZG组明显优于BML组；加入SP600125或SB203580后，显著抑制ZG和BML对磷酸化JNK或p38蛋白的诱导作用。 3.3JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞增殖的调控 结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著促进MC3T3-E1细胞增殖（P＜0.01）；ZG组显著优于BML组（P＜0.01）；加入SP600125或SB203580后，抑制ZG组和BML组对MC3T3-E1细胞增殖的诱导作用（P＜0.05或P＜0.01）。 3.4JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞周期分布的调控 细胞周期分析结果显示，与control组比较，ZG组G1期的细胞百分率显著下降（P＜0.01），S期的细胞百分率变化不显著（P>0.05），G2/M期的细胞百分率显著增加（P＜0.

23%。 1.2细胞凋亡结果显示CML CD34+干/祖细胞对IM不敏感；经过IM处理后miR-21表达水平有一定的上调；转染antagomiR-21能显著增加IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡，细胞凋亡率由对照组的3.983±0.2973增加至9.437±0.5601。

1.3Sup-15细胞对IM诱导的细胞凋亡不敏感；在IM处理后miR-21表达也发生一定的上调；转染antagomiR-21明显地增强IM诱导Sup-b15细胞凋亡。 1.4IM对K562和Ku812细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用随着IM浓度的升高以及处理时间的延长显著升高；在IM处理后K562和Ku812细胞的miR-21表达均下调；转染agomiR-21能抑制IM诱导K562和Ku812细胞凋亡。 2.探讨miR-21调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究 2.1IM处理后CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的PDCD4表达水平下调，K562和Ku812的PDCD4表达水平上调；而CML CD34+干/祖细胞和三种Ph+白血病细胞（K562、Ku812、Sup-b15）的PTEN表达水平均下调；转染antagomiR-21后CML CD34+干/祖细胞PDCD4、PTEN和p-AKT的表达水平均下调。 2.2使用PI3K抑制（Wortmannin和LY294002）阻断PI3K/AKT信号通路后，IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15的细胞凋亡显著增加。 2.3使用PI3K抑制剂（Wortmannin和LY294002）阻断PI3K/AKT信号通路后，IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的p-AKT蛋白表达均显著下调。 结论 miR-21通过PI3K/AKT信号通路介导CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞对IM的凋亡抗性。
HER3与HER2同属EGFR (epidermal growth factor MG-132数据表 receptor)家族的重要成员，同为跨膜酪氨酸激酶受体(RTK)，其与多种人类癌症的形成、进展有关。研究发现HER3蛋白与HER2蛋白的表达高度相关，HER3是辅助HER2形成异源二聚体及致癌作用的重要因子之一。在乳腺癌患者中，HER2、HER3阳性率分别达到50%、41.8%。当乳腺癌患者HER3、HER2同为阳性时，其对HER2靶向药物曲妥珠单抗（Herceptin）的反应效果不佳。因而，通过抑制或阻断体内HER3水平，可能是治疗乳腺癌等癌症的一种重要途径。 【目的】 Ki16425 本研究采用人源化抗体库构建及筛选新思路，即将免疫后的鼠源VH-CDR3库(librare of CDR3of variable region of the murine heavy chain)移植到修饰后的人源scFv(single-chain antibody fragment)框架上，构建抗HER3人源化单链抗体基因库，并对该人源化抗体基因库进行筛选，以期获得具有潜在应用价值的抗HER3人源化单链抗体。另一方面拟通过本论文的实施，建立一种新的人源化抗体筛选技术，为快速获得人源化抗体提供一个新参考。

【方法】 1.人源化抗体基因库构建：采用HER3抗原免疫Balb/c小鼠，当抗血清效价达到1：200000时，从被免疫的小鼠脾细胞中提取总RNA，经反转录PCR（RT-PCR）获得总cDNA。以总cDNA作为模板，采用兼并引物进行PCR扩增，从而获得鼠抗体重链可变区基因库（VH），然后再以VH为模板，扩增出鼠VH-CDR3基因库。将鼠VH-CDR3库通过PCR扩增技术移植到经过修饰的人源单链抗体VH3-VΚ1上，实现抗HER3人源化抗体基因库的构建。 2.核糖体展示技术富集筛选：针对HER3抗原，经三轮兔网红细胞核糖体展示富集抗HER3的单链抗体基因。为便于后续基因库的高效克隆和表达，对回收的人源化抗体库进行基因结构单元的改进，即在基因库的N-端添加T7启动子、SD序列、PelB等表达原件，C-末端添加携带2个(His)6标签的序列，构建可直接用于TA克隆和表达目标蛋白的人源化抗HER3单链抗体基因库。

3.人源化抗体筛选与鉴定：展示后回收的HER3单链抗体基因库通过TA克隆，转化至大肠杆菌BL21（DE3），用菌落PCR鉴定克隆。分别用HER3抗原和抗VH3-VΚ1兔多克隆抗体等对筛到的阳性克隆的可溶性表达产物进行ELISA筛选，随之对亲和力较高的菌株表达产物进行纯化并测定其亲和常数。 【结果】 本研究成功构建了一个库容达1012的人源化抗HER3单链抗体基因库，经过三轮核糖体展示对抗HER3抗体基因库进行了富集，通过改良的TA克隆技术对目标基因库进行了克隆、表达以及产物鉴定。通过对亲和力较高菌株的表达产物进行纯化并测定其亲和常数，成功获得亲和力达3.02110-8M的人源化抗HER3单链抗体。 PDK1 assay 【结论】 本研究为开发抗HER3抗体新药研究提供了有价值的先导抗体分子。此外，通过本课题的执行，建立了一种快速筛选人源化单链抗体的新技术途径，从而为其它人源化抗体的筛选提供一个有价值的参考。
目的:探讨Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤发病机制中的可能作用。莫罗尼鼠白血病病毒前病毒整合基因(Proviral integration of moloney murineleukemia virus，Pim)是一种原癌基因，它编码的蛋白是丝/苏氨酸激酶中的一种，主要涉及细胞周期的调节、蛋白质的转录与翻译、促凋亡、细胞代谢的调节及介导耐药蛋白的产生，与肿瘤的发生密切相关。Pim家族由Pim-1、Pim-2、Pim-3成员组成，可根据选择不同的转录位点编码不同的蛋白，均属于钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶家族。但它们在不同组织中得表达情况却不一样：Pim-1高表达于造血细胞，Pim-2高表达于脑和淋巴细胞，而Pim-3则高表达于肾脏、乳房和脑细。已有文献显示[29]骨髓瘤细胞系中不同程度的表达Pim-1、Pim-2及Pim-3。C-myc是一种多功能的原癌基因，位于人类染色体8q24上，其不仅具备转录因子的功能促进细胞增殖，还可以抑制细胞的分化、促进细胞周期的进展并抑制细胞的凋亡。C-myc基因能够通过扩增和染色体易位重排而激活，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，已发现在多种人类肿瘤包括乳腺癌、急性白血病、骨肉瘤中的表达上调，而在小鼠浆细胞瘤和人类多发性骨髓瘤患者中也均发现C-myc的重排和过度表达。本课题采用RT-PCR和Western Blot两种方法检测Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤患者及正常对照组中的表达情况并探讨Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤发病机制中的可能作用，为多发性骨髓瘤的诊疗提供新的思路及方法并寻找相关的理论依据。 方法:1.选取2012.07-2013.09来本院就诊的22例初诊MM患者骨髓液作为初治组，选取2013.01-2013.09初诊的10例排除恶性血液病患者（排除肿瘤、感染、免疫系统疾病等影响试验结果疾病）骨髓液作为正常对照组。2.

7细胞)共培养模型进一步验证以上结论。同时,对去卵巢诱导骨质疏松大鼠给予二甲双胍干预下,检测OPG/RANKL的表达并运用骨密度、骨组织形态计量学、破骨细胞染色计数等手段来综合评价二甲双胍对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用。 结果： 1、二甲双胍对成骨细胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表达的影响 A、二甲双胍对头盖骨成骨细胞及MC3T3-E1呈浓度及时间依赖性增加OPGmRNA水平的表达。RT-PCR结果显示：与对照组相比,不同浓度二甲双胍(200-800μmol/L)分别作用于成骨细胞48h,均可呈剂量依赖性促进头盖骨成骨细胞OPG 以及 mRNA的表达(P< 0.001),800μmol/L时OPG蛋白的表达最高。为明确二甲双胍上调成骨细胞OPG的作用机制,本研究使用了各种不同抑制剂。结果示AMPK以及CaMKK特异抑制剂compound C和STO-609,而非MEK1、p38、NF-кB特异抑制剂PD9805、SB203580、Bay-117028降低二甲双胍对成骨细胞OPG上调作用。 C、二甲双胍减少成骨细胞RANKL mRNA和蛋白的表达。本研究发现二甲双胍呈剂量依赖性减少头盖骨成骨细胞RANKL mRNA水平的表达。Western

blot结果同样示二甲双胍呈剂量依赖性减少RANKL表达。 D、二甲双胍能抑制破骨细胞分化。本研究使用二甲双胍与维生素D3共同作用成骨细胞的上清液诱导Raw264.7细胞分化并进行TRAP染色计数。结果示随着二甲双胍浓度的增加,破骨细胞呈剂量依赖性减少。为明确破骨细胞的存在,本研究进一步行RT-PCR检测破骨细胞特异基因TRAP和cathepsin

K表达,结果示上述基因表达随时间的增加而增加。由此可知,二甲双胍是通过调节成骨细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞分化。 2、二甲双胍对去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响及对骨质疏松防治作用的实验研究 A、动物实验中证实,二甲双胍能上调去卵巢大鼠OPG、下调RANKL表达的影响。ELISA结果示二甲双胍能增加去卵巢大鼠血清OPG的表达；Western blot结果示二甲双胍能下调去卵巢大鼠骨髓组织中RANKL的表达。 B、二甲双胍能抑制破骨细胞形成及骨丢失。 骨密度检测：三组大鼠间股骨的骨密度均有差异(P<0.001)。OVX组低于Sham组(P<0.001),而OVX+Met组明显高于OVX组(P
矽肺(Silicosis)是由于在生产过程中长期吸入含有游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘而引起的以矽结节形成和肺间质纤维化(pulmonary interstitial fibrosis,PIF)为主的职业性肺病,以肺泡持续性损伤、成纤维细胞(fibroblast,FB)增殖及大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积而导致肺组织反复破坏、修复,最终造成肺组织中大量胶原沉积为病理特点。 Integrase抑制剂 以往研究表明,矽肺纤维化的发生、发展是复杂的多阶段过程,其中有众多细胞因子、蛋白酶系统和转录因子等的参与及相互作用,因而有可能涉及众多基因的表达活动。该过程中的基因表达十分错综复杂,单个特异基因表达的分析方法不能阐述其复杂的机制。所以,利用基因芯片将在此过程中可能存在着的相互协调的基因群体作为一个整体系统进行研究,大规模地筛选出在矽肺纤维化发生发展过程中起关键调控作用的差异表达基因,是从基因水平深入探讨矽肺纤维化发病机制的新思路。

目的 本实验以SD大鼠气管灌注SiO2粉尘制作矽肺模型,采用基因芯片技术对染尘的实验组肺组织和灌注生理盐水的对照组肺组织基因表达谱进行比较研究,在基因组范围内大规模筛选矽肺病差异表达基因,并利用多种方法对差异表达基因进行验证,以期发现重要的矽肺病相关基因,为有效地预防、治疗这一顽疾提供靶点。 方法 1.购进30只SD大鼠后,先适应性饲养一周,采用随机数字表将大鼠分为2个组,即对照组和实验组,对照组6只,实验组24只。其中实验组又分为3个时间点,分别为30d、60d和90d,每个时间点8只大鼠。 2.对实验组大鼠采用非气管暴露法染尘制作矽肺大鼠模型,对照组灌注生理盐水。经HE切片确定建模成功,Van Gieson(VG)染色看胶原纤维生成情况。 3.提取总RNA,用紫外分光光度计法检测RNA的纯度,并取总RNA样品进行甲醛变性凝胶电泳,检测总RNA完整性。 还有 4. RNA质检合格后,选择实验组大鼠60d和对照组大鼠肺组织的总RNA,选用博奥生物有限公司提供的27K Rat Genome Array共有约26962条70 mer长度的Oligo DNA,进行基因芯片杂交。 5.比较染尘的实验组和灌注生理盐水的对照组肺组织芯片结果,找出差异基因,并用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot在组织标本上进行鉴定。 6.应用凝胶图像分析系统对RT-PCR结果进行图像采集和分析,应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组织化学结果进行图像采集和分析测定,用Image J分析软件对Western Blot结果进行半定量分析处理。资料整理后,应用SPSS Statistics V17.0统计软件,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析。 结果 1.肺组织切片HE染色可见,对照组各时间点大鼠肺组织结构清晰,仅见轻微炎症反应;实验组大鼠肺组织正常结构破坏,肺组织局部病灶融合成较大的肉芽肿,其中可见较多的巨噬细胞、淋巴细胞等,形成大小不一的矽结节。肺组织切片VG染色可见,对照组大鼠各时间点及实验组大鼠30d、60d的肺组织仅见血管壁的基底膜上胶原纤维呈红色,实验组90d的矽结节内可见呈红色的胶原纤维。 2.肺组织总RNA质量检测,经紫外分光光度计测定,实验组的各时间点和对照组的大鼠肺组织总RNA OD260/OD280>1.9。甲醛变性凝胶电泳显示,各样品电泳图谱有清晰的28S、18S条带和一条浅的5S条带,且肉眼观察28S条带亮度约为18S的1.5倍。 3.

无内毒素糖基化修饰的白蛋白(脂蛋白)制备与鉴定 1.无内毒素AGE-HSA的制备与鉴定 按文献方法体外制备无内毒素AGE-HSA修饰蛋白。将1.75g/L纯化的HSA分别置于含或不含0.1mol/L D-葡萄糖的0.4M磷酸盐缓冲液中,37℃孵育8周；用pH7.4磷酸盐缓冲液透析以除去葡萄糖。以在同样条件下不含葡萄糖的缓冲液中孵育8周的HSA作为对照,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌消毒后,制备的样本经荧光分光光度分析法鉴定,4℃无菌保存。所有制备AGE-HSA和未经修饰的HSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。 或者 2.无内毒素AGE-LDL的制备与鉴定 根据文献方法,将购买的LDL(2 mg protein/ml)和0.2M D(+)-glucose,以及抗氧化剂(1mg/ml EDTA和10μM BHT)混合均匀,无菌的氮气条件下,37℃孵育4周。制备出AGE-LDL在4℃,pH7.4无内毒素的PBS中透析24小时,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。制备的AGE-LDL与LDL比较(以LDL为标准)。使用trinitrobenzene

sulphonic acid assay (TNBS法)检测游离蛋白含量(AGE-LDL 0.72±0.032AU VS. LDL 1.00±0.001AU, P0.05);琼脂糖凝胶电泳迁移率实验(AGE-LDL 1.18±0.32 VS. LDL 1.00±0.000, P>0.05);以上实验表明AGE-LDL制备成功。所有制备AGE-LDL和未经修饰的LDL经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。 二.人肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)的培养 人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞系)细胞购自美国ATCC库。细胞复苏后在37℃,5%CO2的条件下,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞长至70%-80%时,改用无血清培养基静置细胞16-24小时后用于实验。本研究使用6-10代细胞进行实验。倒置显微镜下观察细胞形态为铺路石样。

三.人肾小管上皮细胞系TLR-4受体的检测和定位 1.流式细胞仪检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体 时间 收集处于对数生长期的HK-2细胞,固定后封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,PBS重悬细胞后,流式细胞仪检测。 2.免疫荧光检测肾小管上皮细胞上细胞膜TLR4受体 人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的培养板上,待细胞生长至约70%融合,固定封闭后,加入兔抗人TLR4一抗过夜,用非免疫羊IgG作阴性对照,FITC荧光标记的兔抗山羊二抗避光孵育,碘化丙啶(PI)室温避光孵育染核,缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察、拍片。 四.AGE-LDL等诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6和IFN-β 人近端肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入LDL(100μg/ml). HSA(100μg/ml).AGE-LDL(100μg/ml)和AGE-HSA(200μg/ml)刺激6小时,提取mRNA,qRT-PCR检测IL-6和IFN-β。或者刺激12小时,集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度。 五.AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的时间、浓度效应 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入25、50、100μg/mlAGE-LDL或100μg/ml未经修饰的LDL,于0、3、6、12及24小时收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 mRNA。或者收集细胞上清,按试剂盒说明,ELISA法检测IL-6在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白量矫正。

人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入或不加入10μg/ml多粘菌素B(PMX-B),孵育2小时候加入100μg/ml AGE-LDL或10gg/ml LPS,6小时后收集细胞提取总RNA,行qRT-PCR检测IL-6 Bcr-Abl抑制剂 mRNA。 六.TLR4介导AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6 1.TLR4 siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入LDL(100μg/ml)、AGE-HSA(200μg/ml)和AGE-LDL(100μg/ml),6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 2.TLR4中和抗体阻断后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6的变化 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入5μg/ml.1 Oμg/ml.20μg/ml兔抗人TLR4抗体或20μg/ml同源非免疫的兔IgG抗体,预孵2小时后,分别加入100μg/mlAGE-LDL,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 3.阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL诱导的HK-2细胞分泌IL-6 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别和TLR4中和抗体20μg/ml预孵2小时或者使用TLR4 SiRNA 100pmol干扰48小时后,加入AGE-LDL 100μg/m1孵育12小时,ELISA检测细胞上清中的IL-6蛋白的水平,并以蛋白浓度校正。 4. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、1、3、6、12及24小时收集细胞。Western-blot检测TLR4蛋白表达情况。 七.

pallidumsubsp.pallidum,Tp)俗称梅毒螺旋体,是人类性传播疾病(STD)梅毒(syphilis)的病原体。梅毒是一种严重危害人类健康的性传染性疾病,其不仅严重损害人体的多个器官从而引起全身性损害,还可由母体经胎盘垂直传播给胎儿,引起早产、流产、死胎和畸胎或胎传梅毒(又称先天性梅毒),严重影响出生人口质量。此外,梅毒与艾滋病的传播途径相同,可
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目的研究栝蒌薤白半夏汤对心肌缺血再灌损伤大鼠心肌细胞凋亡及P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响。方法将40只大鼠随机分为假手术组(A)、缺血再灌注组(B)、缺血预处理组(C)、栝蒌薤白半夏汤组(D)、阻断剂(203580)+栝蒌薤白半夏汤组(E)5组,每组8只。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血再灌注损伤模型,各组动物至实验时限(缺血30min再灌注90min)后,取出心脏。采用末段探针标记(TUNEL)和免疫组化方法进行细胞凋亡率及P38MAPK表达测定。结果

B组心肌细胞凋亡率显著升高,P38MAPK表达水平明显下降,与A组比较,差异有显著统计意义;B、E两组结果比较,组间差异无统计学意义;D组能有效激活P38MAPK表达水平,降低心肌细胞凋亡率,与B组比较差异有显著统计意义。结论栝蒌薤白半夏汤能够有效抑制心肌细胞凋亡,其作用机制之一可能与P38MAPK的激活相关。
目的:观察丹参(Salvia selleck kinase 抑制剂 miltiorrhiza)对大鼠小肠缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)中肾脏p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)信号转导通路的影响。方法:雄性SD大鼠36只,随机分为空白组、缺血再灌注组、丹参处理组。采用钳闭大鼠肠系膜上动脉缺血再灌注模型。酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked

immuno-sorbent assay,ELISA)测定肾组织中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量,蛋白印记(Western MLN2238半抑制浓度 blot)法检测肾组织中磷酸化p38丝裂素活化蛋白激酶(Phospho-p38 mitogen-activated protein kinase,P-p38MAPKs)的表达;紫外分光光度法检测血浆二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)的活性;HE染色形态学方法评价肠及肾组织损伤;血清生化分析仪检测尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(Crea,Cr)。结果:缺血再灌注组与空白组比较,小肠及肾组织结构损伤严重,肾脏中p38MAPK、TNF-α和IL-1β表达明显增高,血浆DAO、BUN、Cr含量升高(P<0.01);丹参处理组与缺血再灌注组比较,肾组织中p38MAPK表达显著降低,肾组织中TNF-α和IL-1β含量减少,血浆DAO含量下降,小肠和肾组织结构损伤显著减轻。BUN、Cr明显降低(P<0.05)。结论:丹参可减轻小肠缺血再灌注肾损伤;其机制与其抑制肾组织中p38MAPK信号转导通路的活化进而减少TNF-α、IL-1β的释放有关。
目的探讨无创肢体缺血预处理(LIP)对兔心肌电稳定性的影响及其机制。方法取兔27只,随机分为:单纯缺血对照组(Ctr组),LIP组,LIP+ATP敏感的钾通道(KATP)抑制剂格列苯脲组(LG组),LIP+丝裂素活化的蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB203580组(LSB组),闭胸状态下同步记录体表ECG及心内、外膜单相动作电位。分析心肌缺血背景下单相动作电位振幅(MAPA)、单相动作电位复极90%时间(APD90)、0期去极化最大速率(Vmax)和心率、心律失常的类型、发生率及持续时间的变化,实验结束后取心肌组织检测其中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量。结果缺血后,四组的平均心率、MAPA、Vmax均不同程度地减小,APD90不同程度地延长;LIP能抑制心律失常的发生,使心律失常持续时间缩短。LG组心律失常发生降低,持续时间缩短,LSB组结果与Ctr组相近。与Ctr组比较,LIP组SOD活力升高;其余三组的MDA含量降低;LIP组NO含量升高,而LG组及LSB组亦低于LIP组(P均<0.05)。结论无创肢体缺血预处理具有增强兔心肌电稳定性、减轻心肌氧化损伤的作用,p38MAPK可能为其发挥保护作用的重要途径,KATP则可能仅在抗氧化和改善供血等方面发挥了作用。
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目的:研究胰腺癌细胞株Panc-1在应用脂多糖(LPS)刺激前后B7-H1表达的变化,并探讨其可能的分子机制。方法:LPS刺激以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的特异性抑制剂处理Panc-1细胞前后,应用Western

和 blotting检测MAPKs信号通路中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和c-Jun氨基端激酶(JNK)磷酸化水平的变化,real-time PCR和Western blotting检测B7-H1 mRNA和蛋白的表达变化。结果:LPS刺激后B7-H1的表达显著上调,p38、ERK和JNK的磷酸化水平也明显上调,加入MAPKs特异性的抑制剂后,LPS诱导的p38、ERK和JNK的磷酸化被抑制,并且在p38和ERK的抑制剂处理后,B7-H1的表达也明显被抑制,而在JNK的抑制剂处理后B7-H1的表达没有显著变化。结论:LPS可以诱导胰腺癌细胞株Panc-1表达B7-H1,并且p38和ERK的活化在LPS诱导的B7-H1的表达过程中起着重要作用。
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目的探讨吡那地尔超极化停搏对大鼠离体心脏p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的影响。方法成年雄性SD大鼠随机分为四组:自然停搏组(A组)、St.

05)。 结论:ET-1通过ETAR上调前列腺癌PC-3细胞COX-2的表达,ETBR未参与次调控过程;p42/44

MAPK, p38 MAPK和EGFR等信号通路参与了此调控过程。提示ET-1拮抗剂联合应用COX-2拮抗剂等信号通路拮抗剂,可为AIPC的治疗开辟新途经。
【引言】 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病,其主要病理变化是含色素的神经元变性缺失,尤以以黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元选择性变性缺失为主。虽然PD的病因仍不明确,但已发现一些与其发病相关的危险因素,如遗传,年龄及环境等。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶( 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahy-dropyridine,MPTP)是一种人工合成的神经毒性物质,能使动物和人出现PD症状。MPTP通过其活性代谢产物MPP(+1-methyl-phenyl 因为 pyridinium cation)使黑质纹状体DA能神经元受损伤。 二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是中药何首乌的有效成分之一。具有抗氧化,清除自由自,抑制单胺氧化酶活性以及改善记忆功能的作用。近年来,TSG的神经保护作用逐渐受到人们的关注。研究证实TSG可改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力,具有神经保护作用,但是TSG对MPP~+诱导的DA能神经元损伤是否具有保护作用,目前尚未见报道。 本研究选择具有DA能神经元特性的PC12细胞建立体外模型,旨在观察TSG对MPP~+诱导的DA能神经元损伤是否有保护作用,并对其作用机制做初步探讨。 【目的】 1.建立帕金森病模型,筛选出MPP~+对PC12细胞损伤的有效浓度和TSG对MPP~+损伤PC12细胞的有效保护浓度; 2.观察TSG对MPP~+诱导的PC12细胞的影响; 3.研究TSG抑制MPP~+诱导PC12细胞损伤的可能机制。 【方法】 1.设立空白对照组,200,300,500,700,800,1000,1200,1500 mol/L MPP~+浓度组作用于PC12细胞24h;TSG保护作用:筛选实验处理浓度设立正常对照组、MPP~+损伤组(500 mol/L)、不同浓度的TSG预处理组(1,5,10,50,100

mol/L),用噻唑蓝(MTT)比色法检测,最终筛选出最佳TSG预处理组浓度(1,5,10 mol/L); 2.设立正常对照组、MPP~+组、不同浓度TSG预处理组(1,5,10 mol/L),用MTT比色试验检测细胞活性;Hoechst 33258染色观察细胞及细胞核形态变化;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡比率;TUNEL染色观察细胞DNA断裂情况; 3.通过蛋白免疫印迹观察细胞中caspase-3、p38MAPK的表达。 【结果】 1. MTT比色法检测显示,与对照组相比,500 mol/L的MPP~+处理24h后细胞活力为48.3±3.6%(P<0.05),74.3±2.7%(P<0.05),86.8±2.0%(P<0.05)和13.4±1.1%(P<0.01),而TSG组TUNEL阳性细胞数则显著降低,分别降为25.3±1.2%(P<0.01),17.3±0.9%(P<0.01)和11.7±0.9%(P
研究背景 布比卡因(Bupivacaine,Bup)是一种酰胺类局部麻醉药,因其良好的麻醉和镇痛效果而在临床上被广泛应用于神经阻滞、椎管内麻醉和硬膜外镇痛。然而,随着应用Bup临床经验的不断积累,在充分肯定其麻醉与镇痛效果的同时,也发现其对神经元有潜在的损伤作用。Bup神经毒性的机制虽然尚未完全阐明,但现有研究认为Bup具有毒性,可引起神经细胞内源性抗凋亡分子表达下调或活性下降,从而导致神经元坏死和凋亡,最终使患者出现运动和感觉异常。已有研究证实,地塞米松(Dexamethasone,

什么 Dex)可显著抑制氧化应激诱导的巨噬细胞凋亡、抑制肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导的甲状腺癌细胞凋亡以及降低细胞毒化疗药物的细胞毒性等。但Dex是否对Bup诱导的神经元坏死或凋亡也有保护作用,目前还不清楚。 研究目的 采用体外培养的小鼠神经细胞株N2a为模型,以文献报道的Bup损伤浓度和Dex保护浓度来探讨Dex对Bup神经毒性的影响,并初步探讨其机制,以期为Bup潜在神经毒性的临床防治提供新的思路和基础数据。 研究方法 所有实验均在小鼠神经母细胞瘤细胞株N2a细胞的体外培养模型上进行。 1.阐明Bup对N2a的损伤作用。评价指标为:细胞形态学、细胞膜完整性(以LDH渗漏率衡量)、细胞核固缩凝集; 2.研究Bup损伤N2a的可能机制。检测指标为:线粒体内膜跨膜电位(ΔΨm)、ERKs和Akt磷酸化激活水平; Anti-infection Compound Library订单 3.明确Dex对Bup所致N2a损伤是否有保护作用。评价指标为:细胞形态学、细胞膜完整性(以LDH渗漏率衡量)、细胞核固缩凝集; 4.阐明选择性阻断Akt磷酸化对地塞米松保护布比卡因神经毒性的影响。评价指标有:细胞形态学、细胞膜完整性(以LDH渗漏率衡量)、细胞核固缩凝集、线粒体膜电位变化。 实验结果 1. Bup导致N2a形态学损伤明显、LDH渗漏率和细胞核固缩率显著增加; 2. Bup作用后,N2a细胞线粒体内膜跨膜电位显著下降、ERKs和Akt被显著脱磷酸化; 3. Dex预处理可显著减轻Bup所致的N2a损伤,并完全逆转Bup所致的ERKs和Akt脱磷酸化作用 4.选择性阻断Akt磷酸化激活,可去除Dex对Bup神经元毒性的保护作用。 结论 地塞米松对布比卡因所致神经元毒性有保护作用,该作用依赖于地塞米松对Akt磷酸化激活水平的维持。
青少年特发性脊柱侧凸患者成骨细胞中核心结合因子ɑ1和骨形态发生蛋白-2的表达及意义 第一部分青少年成骨细胞的体外分离、培养、扩增及表型鉴定 目的建立青少年成骨细胞(osteoblast,OB)体外分离、培养、扩增及表型鉴定的方法,为后续分子生物学检测做准备。 方法试验对象为2008年03月至2009年04在我院行后路手术的女性AIS患者26例。根据测量的骨密度值,将AIS患者分为两组:A组15例,为骨量正常患者,年龄12~18岁,平均14.6岁;B组11例,为骨量减低患者,年龄12~18岁,平均14.

JNK、p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和对照组相比明显上调(P＜0.01),ERK和Bcl-2的表达则下调(P＜0.05)。p38的表达在蜈蚣醇提液各治疗组和对照组间无明显差异性(P＞0.05)。

2.蜈蚣醇提液各治疗组p-ERK1/2的表达水平相对于对照组明显下调(P＜0.01),抑制剂组p-ERK1/2较对照组明显下调(P＜0.01);蜈蚣醇提液各治疗组p-JNK1的表达水平相对于对照组明显上调(P＜0.01),抑制剂组p-JNK1蛋白的表达较等量蜈蚣醇提液组明显下降,但高于对照组,有显著性差异(P＜0.01);蜈蚣醇提液各治疗组p-p38的表达水平相对于对照组无明显差异性(P＞0.05),抑制剂组p-P38蛋白的表达较对照组明显下调(P＜0.01)。 BMS 354825 3.相关性分析结果:ERK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈负相关(r=-0.965,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01);和Bcl-2的表达呈正相关(r=0.946,P＜0.01)。JNK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈正相关(r=0.913,P＜0.01;r=0.931,P＜0.01;r=0.937,P＜0.01);JNK与Bcl-2的表达呈负相关(r=-0.883,P＜0.01)。 结论: 1蜈蚣醇提液可能通过阻断ERK1/2通路和激活JNK1通路来抑制Bel-7402的增殖,诱导其凋亡。 2.ERK1/2通路抑制、JNK1通路激活后可能诱导蜈蚣醇提液各治疗组p53、Bax和caspase-3的表达上调和Bcl-2的表达下调,提示蜈蚣醇提液可能通过多途径抑制Bel-7402生长,诱导其调亡。
心肌肥厚是心脏对多种疾病包括高血压、机械负荷、心肌梗塞、心律失常、内分泌机能紊乱的适应性反应,是心脏输出做功增加的最初代偿性机制反应。持续性的心肌肥大能够引起扩张性心肌病,心衰甚至猝死。心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素。

影响心肌肥厚的因素主要包括:一为机械性因素,包括压力负荷与容量负荷;二为神经性与体液性因素,包括肾素–血管紧张素系统–醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone 时间 system,RAAS)、交感神经系统、肾上腺髓质激素、甲状腺素、内皮素(ET)、心肌肥厚肽、醛固酮(ALD)、心房钠尿肽(ANP)、一氧化氮(NO)等。研究表明,RAAS对维持心血管系统功能稳定非常重要,并且在心肌肥厚发生中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)具有正性变力作用和强烈的血管收缩作用,能刺激细胞蛋白质合成,参与了心肌肥厚的早期信号传导。心肌肥厚包括心肌细胞体积的肥大和心肌间质细胞增殖两个最基本的过程。因此,开发一种有效的抗心肌肥厚的药物是心血管研究中的重要课题。先前实验研究表明单味蜈蚣有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化等作用,离体实验证实,蜈蚣的成分提取物酸性蛋白(Centipede

Acidic Protein,CAP)浓度依赖性的提高窦房结频率,增强心肌收缩力等广泛的心血管作用。 本实验通过细胞免疫化学、流式细胞术、激光共聚焦、分子生物学(Western blot,RT-PCR)等技术在整体水平研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚模型及急性心力衰竭大鼠的作用;从细胞与分子水平研究CAP对培养的乳鼠心肌细胞凋亡及心肌成纤维细胞增殖的作用及其机制: 此网站 (1)CAP对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究; (2)CAP对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响; (3)CAP对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制研究; (4)CAP对急性心力衰竭大鼠心功能的影响。 第一部分蜈蚣酸性蛋白对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究 目的:研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚(pressure-overload induced cardiac hypertrophy,POH)模型大鼠的作用及机理。 方法:大鼠随机分为4组:假手术组(saline,1ml·100g-1,i.p.)、模型对照组(saline,1ml·100g-1,i.p.)、卡托普利组(captopril,30mg·kg-1,i.g.)、CAP干预组(CAP,2.0g·kg-1,i.p.)。采用大鼠腹主动脉缩窄术复制POH模型。于术后第8周测定心功能及血液指标,包括心率(HR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)、左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)、左室质量指数(LVMI)、AngⅡ、ET、ALD、ANP、NO、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)。取部分左室游离壁中段心肌组织,经全自动图象分析系统行图象分析:HE染色观察心肌病理改变并测量各组心肌细胞直径(MD);Masson染色观察心肌胶原变化并计算心肌胶原容积分数(CVF)。 结果: 1、POH组HR为384.0±21.5,SBP、DBP、MBP分别为28.12±1.75、18.24±1.18、24.78±1.27,与假手术对照组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.05或P<0.05或P<0.05),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)caspase-3活性分别为1.2±0.4、1.8±0.5,明显低于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01)。AngⅡ组Bcl-2蛋白表达显著降低为11.95±3.98,与空白组相比有显著性差异(P<0.01),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)组Bax蛋白表达分别为22.26±6.53、17.34±4.05,明显高于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)组CaN蛋白表达分别为11.28±2.68、14.82±3.67,明显低于AngⅡ组(P<0.

体外培养支气管上皮细胞(16HBE),分别用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-8.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+扶正解毒(FJD)含药血清(低、中、高剂量组、空白血清组)处理细胞24h,用台盼蓝法检测支气管上皮细胞的存活率。取对数生长期的16HBE细胞接种于24孔培养板内,6×106个／孔,每个剂量设5个复孔,按实验分组分别加入受试物,继续培养24h,各组细胞弃去上清液,每孔加入500μl细胞裂解液,冰上放置30min,将裂解液作用后的各组细胞转移至Eppendorf管,离心20min,取上清液进行谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)活性检测。将受试物处理后的各组细胞以PBS反复洗涤细胞,直至显微镜下大部分细胞已超声破碎,进行超氧化歧化酶(SOD)活性的检测。用考马斯亮兰蛋白测定法,用分光光度计测定波长595nm处吸光度OD值,计算蛋白含量,结合蛋白浓度计算16HBE细胞(细胞处理方法同前)内丙二醛(MDA)含量。2.将16HBE细胞接种于25ml培养瓶中,每孔接种的细胞数为6×106,培养24h后,用NiS

(1-5.0μmol/L)染毒,并用无菌的MEM、NiS (2.0μmol/L)+不同剂量FJD含药血清、空白血清、以及三种抑制剂,磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)处理细胞24h,无菌PBS洗涤细胞2次,胰酶消化后制成细胞悬液,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(Western 和 blot)法观察各组细胞中磷酸化ERK、P38和JNK的表达。3.将16HBE细胞用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-4.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+FJD含药血清(低、中、高剂量组)处理细胞24h后,用免疫组化法检测各组细胞中核转录因子(NF-κB)κB的活性,并进行半定量分析,用RT-PCR法测定支气管上皮细胞中NF-κB P65的表达。本次实验采用SPSS13.0统计软件进行相关分析,多组间比较采用方差分析,两组之间的比较采用T检验,P0.05)。NiS能明显激活细胞P-JNK的表达(P0.05),阴性对照组细胞中P-ERK1表达值为0.210,NiS浓度分别为1、2、4.0μmol/L,染镍组细胞中P-ERK1表达值分别为0.216、0.219、0.226,FJD低、中、高剂量含药血清组和P-ERK1抑制剂对磷酸化P-ERK1的表达无明显影响(P>0.05)。4.NiS能明显激活NF-κB和NF-κB

获悉更多 P65的表达(P
第一部分 P38 MAPK在变应性鼻炎大鼠鼻腔粘膜中的表达 目的：探讨p38 MAPK蛋白及mRNA在变应性鼻炎大鼠和正常对照大鼠鼻腔粘膜中的表达情况。 方法：建立SD大鼠变应性鼻炎动物模型,采用免疫组织化学染色法检测p38MAPK蛋白在变应性鼻炎组大鼠和正常对照组大鼠鼻腔黏膜中的表达差异,采用实时荧光定量RT-PCR检测两组大鼠鼻腔黏膜p38 ARRY 162 MAPK mRNA表达水平。 结果：免疫组化染色结果显示p38 MAPK在变应性鼻炎组大鼠鼻腔黏膜中的表达较正常对照组大鼠明显增高(P＜0.05)。实时定量RT-PCR检测结果显示p38 MAPK mRNA在变应性鼻炎组大鼠鼻腔黏膜中表达较正常对照组明显增高(P＜0.05)。 结论：p38 MAPK在变应性鼻炎大鼠鼻腔黏膜中表达水平增高,提示p38 MAPK可能参与了变应性鼻炎的发病过程。 第二部分 P38 MAPK在变应性鼻炎大鼠PBMCs中的表达及对Th2类细胞因子的调控作用 目的：探讨变应性鼻炎大鼠外周血单个核细胞(PBMCs)中p38 MAPK蛋白及mRNA的表达情况,同时探讨p38 MAPK特异性抑制剂SB 239063对外周血单个核细胞Th2类细胞因子IL-4,IL-5表达的影响。 方法：建立变应性鼻炎大鼠模型,通过心脏穿刺获取外周血,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs,实时荧光定量RT-PCR检测大鼠外周血单个核细胞p38MAPK

mRNA的表达。Western blot检测外周血单个核细胞p38 MAPK蛋白的表达水平及活性情况。PBMCs在不同浓度p38 MAPK特异性抑制剂SB 239063作用下培养后,ELISA检测细胞上清液中IL-4, IL-5蛋白表达水平。 结果：结果显示变应性鼻炎组大鼠p38 MAPK mRNA的表达量及蛋白总表达量明显高于对照组(P＜0.05),AR组大鼠磷酸化p38 MAPK(代表p38 MAPK的活性)表达量较对照组升高,磷酸化p38 MAPK与总p38 MAPK的比值也较对照组明显增高(P
目的1.研究正常妊娠、子痫前期胎盘组织中神经激肽B(neurokinin B, NKB)及其受体(neurokinin B receptor, NKR)在蛋白和mRNA水平的表达,以及正常妊娠、子痫前期孕妇血浆中神经激肽B的含量,籍此探讨神经激肽B和子痫前期的关系； 2.研究活化状态的p38MAPK蛋白在正常与子痫前期胎盘中的表达,探讨NKB与p-p38MAPK表达的相关性。 方法选择正常妊娠、轻度子痫前期、重度子痫前期患者各20例,采用酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测孕妇血浆中NKB含量；采用伊红—苏木素(HE)染色,光镜观察正常妊娠和子痫前期胎盘结构的病理学改变；用免疫组织化学检测胎盘组织中NKB/NKR、p38MAPK蛋白的定位及定量表达；用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerasechain reaction, RT-PCR)检测胎盘组织中NKB/NKR mRNA的表达。 结果1.轻度及重度子痫前期孕妇血浆中NKB水平明显高于正常孕妇； 2.

231），但在N分期中Fli-1的表达有差异（p=0.03）。在小细胞肺癌中，不同性别之间的Fli-1表达水平无差异，同样不同年龄分层之间Fli-1的表达水平无差异。 结论：本研究发现Fli-1在小细胞肺癌组织中的表达水平和表达强度显著高于癌旁组织和非小细胞肺癌组织，Fli-1可成为诊断小细胞肺癌的一种分子学标志物；同时Fli-1在广泛期小细胞肺癌中的表达阳性率和表达强度高于局限期，在IV期中表达强度高于I-III期，它可成为判断小细胞肺癌分期的相关指标。Fli-1的表达水平与淋巴结转移有关，N分期高的小细胞肺癌其Fli-1的表达水平增强，可推测Fli-1在小细胞肺癌侵袭转移中起一定作用。本研究结果推测Fli-1基因在恶性肿瘤进展过程中扮演着重要角色，它可能成为小细胞肺癌的潜在治疗靶点，本研究可为小细胞肺癌的分子发病机制及新型靶向药物研发提供临床数据。
目的:使用荧光共振能量转移试验（FRET-VWF73）的方法，对造血干细胞移植（HSCT）患者移植预处理前及预处理后的ADAMTS13活性及其抑制物进行检测。探讨ADAM-TS13活性减低的原因，评估ADAMTS13的活性及抑制物在移植过程中的意义。

方法:(1)移植病例：取自2010年09月至2011年09月间我院行HSCT的血液系统疾病患者共113例（男66例，女47例），中位年龄32（18～57）岁。按疾病诊断分：急性髓细胞性白血病（AML）39例，急性淋巴细胞性白血病（ALL）24例，慢性髓细胞性白血病（CML）16例，急性杂合细胞性白血病（AHL）4例，淋巴瘤13例，其他17例。按移植类型分：自体移植16例、异基因移植97例（同胞全相合异基因移植48例、无关供体全相合异基因移植30例、单倍体异基因移植10例，脐血干细胞移植9例）。预处理根据移植类型分别采取改良BUCY，TBI+CY，BEAM等方案。 或者 (2)使用FRETS-VWF73荧光底物检测的方法检测113例移植病人预处理前后ADAMTS13的活性。 (3)检测其中83例病人ADAMTS13抑制物的含量：将待测血浆56℃环境中灭活1h，然后取灭活后的血浆与正常人混合血浆混匀后于25℃条件下孵育2h。利用FRETS-VWF73荧光底物检测的方法对孵育后血浆的ADAMTS13活性进行检测。 (4)统计分析：数据采用均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析，两样本平均值的比较采用t检验，率的比较采用卡方（X2）检验，以P
目的：探讨蓝萼甲素（Glaucocalyxin

A,GLA）对人肺癌A549细胞的抑制作用及其作用机制，为GLA的抗肿瘤作用及用于临床提供进一步的实验依据。 方法：以不同浓度的GLA干预体外培养人肺癌A549细胞,用MTT法观察其对A549细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化; Hoechst33258染色观察给药后A549细胞核形态的变化，透射电镜（TEM）观察A549细胞超微结构的改变,扫描电镜(SEM)观察A549细胞表面结构改变;western blot法检测GLA对caspase-3、8和PARP蛋白表达的改变。RT-PCR方法检测GLA对A549细胞内caspase-3、8和PARP基因表达的影响。实时定量(Real 获悉更多 time)PCR检测A549细胞内microRNA30a的表达情况。 结果：GLA对体外培养A549细胞具有增殖抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量和时间依赖趋势；Hoechst33258染色后，荧光显微镜下可见A549细胞胞核致密浓染;TEM观察可见A549细胞核皱缩、染色质边集等细胞凋亡的特征性改变；SEM观察可见A549细胞微绒毛减少，部分细胞膜表面出现一些大小不一的凹陷或孔洞。流式细胞仪PI单染结果显示不同浓度GLA作用A549细胞48h后，S期细胞比例增加（P＜0.05）；AnnexinⅤ-FITC双染结果显示不同浓度GLA作用于A549细胞48h后,细胞凋亡率逐渐增加（P＜0.01），3-甲基腺嘌呤(3-MA)与GLA联合应用可使细胞凋亡率增加（P＜0.05）；GLA干预A549细胞后Western BMN 673体内 blot检测结果:caspase3、caspase8、PARP蛋白表达上调，且均呈剂量依赖趋势；RT-PCR结果：caspase-3mRNA、caspase-8mRNA、PARPmRNA的表达上调（P＜0.05），Real time PCR结果表明，microRNA30a表达下调（P＜0.05）。 结论：蓝萼甲素(GLA)对体外培养人肺癌A549细胞的增殖具有一定的抑制作用,并可诱导细胞凋亡和自噬，且可使A549细胞阻滞在S期，其诱导细胞凋亡的机制可能与激活caspase-8信号通路和下调microRNA30a有关。
研究背景 依他尼酸(EA)是一种谷胱甘肽转移酶(GSTπ)抑制剂,具有较弱的抗肿瘤活性。但由于EA生物利用度低,副作用大,限制了其在临床的进一步应用。根据生物等电子重排原理,我们设计并合成了一系列EA嗯二唑衍生物,通过筛选,发现化合物5-[2,3-二氯-4-(2-亚甲基-1-代丁基)氯苯]-3-甲基-1,2,4-噁二唑(6r)具有较高的抗肿瘤活性,具有进一步研究成为抗肿瘤药物的价值。

实验方法 体外实验：MTT法评价化合物6r对一系列肿瘤细胞增殖的抑制作用,并选取敏感细胞株人结肠癌SW620细胞及人前列腺癌PC3细胞进一步研究。Hoechst33258染色法,FITC-AnnexinV/PI双染法检测6r对肿瘤细胞凋亡的影响；碘化丙啶(PI)单染法检测6r对肿瘤细胞周期的影响。Western blotting法检测6r对肿瘤细胞中GST71, EGFR, PI3K/Akt信号通路分子及周期蛋白Cyclin D1表达水平的影响。 体内实验：分别构建裸鼠皮下接种结肠癌SW620细胞移植瘤,皮下接种前列腺癌PC3细胞移植瘤以及原位接种标靶荧光素酶基因前列腺癌PC-3M-Luc-C6细胞移植瘤模型,以6r治疗组,5-氟尿嘧啶(5-Fu)或米托蒽醌(Mitoxantrone, MA)阳性对照组及溶剂阴性对照组进行裸鼠实验。采用尾静脉方式给药,隔天给药并连续给药数周。实验结束后,处死裸鼠,取出肿瘤并称重,通过与阴性对照组比较评价6r体内抗肿瘤活性。Western blotting法检测6r对肿瘤组织中GSTπ,凋亡相关蛋白Caspase-3, bcl-2/Bax, Cyt-C及EGFR/PI3K/Akt表达的影响 实验结果 体外实验结果：体外生长抑制试验结果表明,6r对大多数肿瘤细胞具有较强的抑制作用,对SW620及PC3肿瘤细胞半抑制率IC50分别为4.89μM和3.79μM,选取敏感肿瘤细胞株PC3及SW620进一步实验。Hoechst33258染色结果显示,2μM,4μM6r可明显诱导肿瘤细胞凋亡。荧光显微镜观察,SW620及PC3细胞核染色质浓染,固缩或聚核膜周边,或呈块状碎裂改变。FITC-AnnexinV/PI双染法试验结果表明,4μM6r处理SW620及PC3肿瘤细胞24h凋亡率分别为28.8%和29.