4%的诱导效率,当不添加TMP时,实验无法获得GFP+细胞,诱导效率为0；当添加的TMP浓度达到1μM时,诱导效率达到最高(约0.4%)。 在iPSCs的诱导过程中,利用TMP系统分别调控三个外源基因人源OCT4、KLF4和SOX2的表达,我们发现无论dd融合蛋白位于2A肽连接的多顺反子载体链的任何位置,都可以成功获得iPS细胞,而且可以获得相近的诱导效率(约0.4%)。进一步对三因子进行表达时间上的调控,发现在重编程过程中,早期和中期的外源OCT4和KLF4的添加不是必需的；但SOX2在这两个阶段的添加至关重要,否则将无法获得iPS细胞。 实验将dd连至人源OKSM四因子piggyBac载体的OCT4上,利用该载体可将猪的胚胎成纤维细胞系诱导成为iPS细胞。对获得的猪iPS细胞系分别进行添加和撤离TMP处理,通过TMP调控外源OCT4的表达。结果显示,TMP添加时,可维持细胞系的ES样形态并显示AP阳性,OCT4免疫荧光染色阳性；TMP撤离后,获得的细胞系呈分化状态,并显示AP阴性,OCT4免疫荧光染色阴性。表明目前获得的猪iPS细胞的多能性的维持完全依赖外源OCT4的持续表达。 对重编程过程中外源OCT4的RNA水平及蛋白水平的检测发现,两者随着诱导时间的推延,在表达趋势上并不一致,提示我们需要关注重编程过程中核心转录因子的蛋白水平情况。本课题首次将蛋白调控系统引入至诱导多能性干细胞的研究中。利用TMP系统调控核心转录因子的蛋白表达时间及剂量,有助于揭示重编程过程中各核心因子的作用机制,该系统为各物种的诱导多能性干细胞的获得及机制研究提供了更精确的蛋白水平的研究平台。
目的：在特发性肺纤维化(IPF)过程中,起主要作用的TGF-β在炎症部位活性增强,使成纤维细胞大量增殖,导致严重肺纤维化,TGF-β通过Smads蛋白的信号转导及调控发挥作用。而Smad-3是介导TGF-β诱导肺纤维化的关键分子,其通过调节靶基因而影响IL-6家族特别是IL-31的表达,进一步影响JAKs/STATs通路,从而引起肺纤维化。这是肺纤维化可能的机制。因此,本项目旨在利用体外培养细胞及BLM诱导小鼠肺纤维化模型,得到TGF-β1-Smad-3-IL-31-JAKs/STATs这条通路,研究这条通路是肺纤维化的可能作用机制,以对肺纤维化的靶向治疗提供一定的线索。

为什么 方法：将75只小鼠按随机数字表法分为3组。其中二组为博来霉素诱导肺纤维化模型组(气管内注射BLM5mg/kg0.1mL),分别为单纯造模组(BLM组,25只)、地塞米松治疗组(DXM组,25只)、每组25只；造模后1天,地塞米松组小鼠腹腔注射DXM5mg/kg1(0.1mL),每天1次,连续28天。另1组为正常对照组(NC组,25只)。给药第3、7、14、21、28天每组分别各处死5只小鼠。取肺组织行常规组织病理学观察；免疫组化检测肺组织中TGF-β1、Smad-3含量;RT-PCR法检测IL-31、STAT-1mRNA的表达量；Western selleck产品 blot测STAT-1蛋白含量；染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测Smad-2/3与IL-31启动子之间的结合联系。同时制得原代肺成纤维细胞,待培养3代后,抑制TGF-β表达,而对TGF-β表达的抑制,会下调Smad-3、IL-31的表达水平。对IL-31表达的降低,则会下调STAT-1的表达水平。同时查看肺成纤维细胞的形态,肺成纤维细胞的增殖特征,肺成纤维细胞的胶原合成；检测肺组织中羟基脯氨酸(HYP)含量。 结果： (1)对小鼠肺初步肉眼观察和对肺组织病理学的观察,可发现由于BLM的诱导作用,BLM组小鼠的肺组织根据时间先后顺序出现由3天时的轻度肺泡炎到14天时纤维化的动态改变。DXM组也呈现类似的病理改变过程,但其程度较BLM组轻,但是,对比NC组,其程度却明显加重。NC组病理变化基本未见,没有明显的肺泡炎和纤维化改变。

那个 (2) TGF-β1在NC组肺组织有弱表达,在BLM组7天-14天表达达高峰,有统计学意义(p<0.05)。DXM组也呈现类似的趋势,但比BLM组的表达明显减轻,有显著的统计学意义(P<0.01)；DXM治疗组HYP含量于14-28天有明显下降(p
运动系统的疾病,例如肌腱撕裂,肌腱炎,骨缺损等尚无理想的治疗方法,影响着人们正常工作和生活。肌腱治疗方法相对滞后,主要原因是肌腱发育分化知识的缺乏。骨发育分化知识较为明了,但再生骨组织缺乏合适的物理支架及相关理论支持。间充质干细胞属于多能性干细胞,经化学或物理因素的诱导,可向骨系、肌腱系、脂肪系和软骨系等分化,是研究细胞分化的良好平台,是组织和器官修复的理想种子细胞。因此,本课题以间充质干细胞作为主要研究对象,分别对转录因子Mkx促进间充质干细胞向肌腱系分化的作用和机制以及仿生电纺羟基磷灰石-壳聚糖纳米纤维支架的物理结构促进间充质干细胞向骨系分化的作用和机制进行了相关研究。 1.

25 Hz的张应变更能促进VSMCs有序排列,经过足够时间的周期性牵张后,较低频率可使VSMCs更有序排列;②张应变可以频率依赖地激活VSMCs的integrin-β1、Rac及p38活性以及细胞骨架微丝系统的聚合程度;③阻断信号分子Integrin-β1、p38以及破坏细胞骨架微丝系统可以显著影响不同频率张应变诱导的VSMCs朝向改变过程;④破坏细胞骨架微丝系统可使不同频率张应变作用下的integrin-β1活化受到抑制,阻断integrin-β1也可抑制p38活性以及细胞骨架微丝系统的聚合程度。 上述结果表明,周期性张应变频率是VSMCs排列的重要调控因素,在一定范围内VSMCs排列应有其最敏感适频率。Outside-in及inside-out信号途径都参与了不同频率张应变调控VSMCs排列的信号转导过程,完整的细胞骨架微丝系统可能是感受应变频率信号的关键结构。周期性张应变频率调控体外培养的VSMCs排列的规律,有助于解释一些临床现象并对血管组织工程的细胞种植调控有重要参考价值。
前言

严重感染是儿科危重症中胃肠功能障碍的常见病因之一,其发病机制与内毒素血症和肠屏障功能破坏密切相关。内毒素系革兰氏阴性杆菌细胞壁成份,其主要生物活性成份为脂多糖(lipopolysacchcride,LPS)。胃肠功能障碍在危重症中的重要性越来越受到重视,被认为是多脏器功能障碍的始发因素之一。小儿胃肠功能障碍和衰竭,常提示病情加重和预后不良。机体在受到革兰氏阴性细菌的感染时,LPS作用于细胞膜受体,通过细胞内信号传递级联使基因表达发生变化,导致宿主细胞因子失控性表达,细胞发生代谢、形态等的变化,介导细胞损伤的发生发展。因此LPS介导的信号转导机制已成为一个广泛注意的研究领域,近年来已取得了不少进展。

http://www.selleckchem.cn/products/MK-1775.html 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者,目前已确定出四条MAPK信号转导通路,即细胞外信号调节激酶(extra cellular signal regulated proteinkinase,ERK)通路、C-Jun氨基未端激酶(C-Jun amino terminal kinase,JNK)通路、P38通路和ERK5通路。JNK信号转导通路是LPS信号转导通路中的一条重要通路,c-jun是JNK下游的直接作用底物。除了被生长因子激活外,JNK通路还能被LPS、TNF-α、L-1、紫外线、射线、热休克、细胞外高渗及DNA变性剂等激活。JNK通路的激活与多种系统的促凋亡作用有关。有研究报道,枯否细胞中JNK是LPS信号转导途径中的重要信号分子;JNK的激活可能参与了脑缺血所致神经元的损伤及脑低氧预适应的发生和发展;在IL-10基因缺失鼠小肠缺血再灌注损伤模型中,也发现了JNK/C-Jun信号转导通路的异常激活。但有关严重感染致胃肠粘膜损伤时JNK/c-Jun通路的变化国内外研究报道还很少。 selleck中国 磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-Kinase,PI3K)是生长因子超家族信号转导过程中的重要分子,Akt是原癌基因c-akt的表达编码的丝/苏氨基酸激酶,是PI3K直接的靶蛋白。PI3K主要通过生长因子与受体结合而激活,具有抗凋亡及促进细胞增殖分化的作用,与多种生物学事件有关,如囊泡运输、细胞骨架重建、细胞存活、肿瘤发生、细胞凋亡等。PI3K信号转导通路作为细胞的主要存活通路,对肠上皮细胞的存活、增殖和重建十分重要。有研究表明,PI3K是激活NF-κB的上游途径,而NF-κB信号转导通路是LPS所介导的信号转导通路中最重要的下游通路,活化的NF-κB可诱导众多炎症相关的特异基因如TNF,L-6,L-8等的表达。但有关LPS与PI3K/AKT信号转导通路的研究很少,国内尚未见报道。 谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是血液循环和组织内游离氨基酸池中含量最丰富的一种氨基酸。肠粘膜和其它迅速增生的细胞的主要能量来源是Gln而非葡萄糖。许多动物实验及临床研究表明,Gln可以从维持肠粘膜屏障、对肠免疫功能的调节以及对肠道氧化损伤的保护作用等三个方面起到对肠屏障功能的保护作用。适当剂量Gln的肠外营养和肠内营养,可以增加肠绒毛高度及粘膜表面积和隐窝深度,增加隐窝细胞的有丝分裂,加快肠上皮细胞的更新速度,增强修复能力,并能促进肠道粘液素的合成,增强肠粘膜细胞间的紧密连接,减少上皮细胞的凋亡,阻止肠粘膜萎缩及炎症所致的通透性增加。目前,对Gln能改善各种病理状态的肠粘膜生长修复作用已给予充分的肯定,尤其在烧(创)伤、感染、手术后、放化疗肿瘤病人已取得一定效果。但其作用机制尚不完全清楚。

所以 总之,LPS通过作用于细胞膜受体,激活多条细胞内信号转导系统,形成一个错综复杂的信号转导网络,最终导致内毒素性休克,全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭等疾病的发生。尤其在小儿,因其自身的免疫功能以及肠道的屏障功能不全,严重感染所致的胃肠功能障碍,常是诱发其它器官功能障碍的原因,治疗有一定的难度,一旦到晚期病死率极高,而小儿胃肠功能障碍的发病机理还不完全清楚,本研究对内毒素血症及谷氨酰胺治疗后小肠粘膜JNK/c-Jun及PI3K/Akt信号转导通路进行研究,旨在探讨LPS引起小肠粘膜损伤及谷氨酰胺对其保护作用的有关细胞信号转导机制,以探索有效的预防和治疗途径。 实验材料与方法 1、材料 用腹腔注射内毒素(4mg/kg大肠杆菌脂多糖O55:B5)方法制备18日龄大白鼠内毒素血症模型。不加任何处理因素为正常对照组,该组8只鼠。腹腔注射生理盐水为假注射对照组,腹腔注射内毒素为内毒素组,腹腔注射内毒素同时腹腔注射谷氨酰胺(2g/kg)为谷氨酰胺治疗组,每组40只鼠,分别于实验开始后2、4、6、24及72h各取8只鼠末段回肠4cm,分别放入10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片;2.

01),较12h显著升高(P<0.05)；NF-κB与DNA的结合率也随PCV2作用时间延长逐渐升高,24h时极显著高于0h和6h(P<0.01),较12h显著升高；p-IκBα蛋白的含量,在PCV2作用24h时达到最高,并且极显著高于Oh、6h和12h(P0.05)外,其余组之间两两差异均显著；p-P38蛋白含量,在PCV2作用6h时有所下降,12h和24h上升,并在24h显著高于6h(P0.05)。结果表明,PCV2能通过激活仔猪淋巴细胞中NF-κB信号,从而对相关炎性细胞因子进行调控。
目的：探讨iRGD（immobilized RGD）肽对超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO）标记人胰腺癌细胞的影响，通过磁共振扫描，分析其最佳和较适宜的标记浓度及范围。 材料和方法：(1)实验主要研究对象为人胰腺癌细胞株（PANC-1，Pancreas ductal epithelial cancer），其特点是分化程度低，良好的细胞主动；（2）按照SPIO浓度不同（铁离子浓度：8.4μg/ml, 12.6μg/ml, 14.7μg/ml,16.8μg/ml, 21μg/ml）分为5个系列，每个系列内以SPIO-PLL和SPIO作为对照，其余按照iRGD肽浓度不同（肽浓度：0.25μg/ml, 没有 0.5μg/ml,0.75μg/ml, 1μg/ml, 1.25μg/ml）分为5个组进行标记，待细胞长至对数期，按照SPIO浓度的不同依次标记人胰腺癌细胞（PANC-1），标记时将iRGD肽同SPIO一并加入，上述系列重复3次。按照相同的细胞数量，留3个孔，不加SPIO及iRGD，作为空白对照组。将标记后的细胞制成标本进行MR（3.0T）扫描，扫描序列包括T2WI-

FRFSE、T2-W PROPELLER及T2*MAPPING序列，通过计算T2WI-FRFSE及T2-W PROPELLER图像上、不同浓度下各标本相对于同系列下SPIO对照组信号强度衰减差值（△S）并进行统计学分析，得出最佳的SPIO及iRGD浓度配比；测量T2*MAPPING序列上T2*及各SPIO浓度系列不同iRGD肽浓度样本相对于同SPIO系列SPIO对照组T2*值变化值（△T2*），并分析；(3)计算分析各不同SPIO浓度系列不同iRGD肽浓度标本相对于PBS空白组的信号衰减值（△S′），找出各SPIO浓度系列下，适宜的iRGD肽浓度范围；（4）以适宜浓度的SPIO及iRGD肽标记细胞，将标记好的细胞进行：a、普鲁士蓝染色，显微镜下观察细胞内的铁沉积情况并照相，计算细胞标记阳性率；b、原子吸收光谱进行铁定量检测，并与SPIO对照组比较。（5）计算适宜SPIO浓度和iRGD浓度组在T2WI-FRFSE序列及T2-WPROPELLER序列上的平均信号变化率(S-SSPIO/

AZD2281溶解度 SSPIO×100%)。（6）将适宜标记组与SPIO-PLL对照组△S进行比较分析（。7）SPIO浓度为21μg/ml时，按5种不同iRGD肽浓度培养细胞，进行台盼蓝染色，测定细胞活力。细胞活力(% ) = (细胞总数-着色细胞数)÷细胞总数×100%。 结果：（1）不同浓度SPIO（铁离子浓度：8.4μg/ml, 12.6μg/ml, 14.7μg/ml,16.8μg/ml, 21μg/ml）标记人胰腺癌细胞，T2WI-FRFSEMR图像上：在SPIO浓度为8.4μg/ml，随着iRGD肽浓度的升高，各样本信号强度逐渐减低，各样本相对于SPIO对照组信号强度△S变化呈“逐渐升高”的趋势；在SPIO浓度为12.6μg/ml时，各样本信号强度先减低后升高，各样本相对于SPIO对照组信号强度△S变化呈“先升高后减低”；而SPIO浓度为14.7μg/ml、16.8μg/ml浓度时，各iRGD肽浓度样本信号强度逐渐升高，各样本相对于SPIO对照组信号强度△S变化呈“逐渐减低”趋势；在SPIO浓度为21μg/ml浓度时，各样本信号强度无一定规律，各样本相对于SPIO对照组信号强度△S变化呈“波浪状”改变，且均为负值；在SPIO和iRGD肽浓度分别为12.6μg/ml和1μg/ml时，样本MR信号强度最低，其△S最大，为243.89±89.1。在T2-W

寻找更多 PROPELLER图像上，各标本扫描图像中，靠中间位置的信号较低，各SPIO浓度系列下不同iRGD肽浓度各样本相对于同系列SPIO对照组△S变化无规律性，部分呈“波浪状”改变，但在SPIO和iRGD肽浓度分别为14.7μg/ml和0.5μg/ml时，样本信号强度最低，其△S最大，为393.88±86.19。T2 *MAPPING序列上，所测T2*值在不同SPIO浓度系列下，随iRGD肽浓度不同，各SPIO浓度系列上各样本的△T2*变化和T2WI-FRFSE序列上相似，在SPIO和iRGD肽浓度分别为12.6μg/ml和1μg/ml时，其△T2*为9.43±7.13，位于所有△T2*曲线的最高点。（2）SPIO浓度为8.4μg/ml，各iRGD浓度样本的△S′，与SPIO对照组样本△S′（604.79±58.64）比较无统计学意义（P＞0.05）；SPIO浓度为12.6μg/ml时，各iRGD浓度样本的△S′，均较SPIO对照组样本△S′（313.03±56.9）大，差异具有统计学意义（P＜0.05）；SPIO浓度为14.7μg/ml时，iRGD浓度为0.25μg/ml时样本△S′为720.92±92.75，较SPIO对照组样本△S′（510.5±73.47）大，具有统计学差异（P＜0.05）；SPIO浓度为16.8μg/ml及21μg/ml，各iRGD肽浓度样本的△S′，较同系列SPIO对照组样本△S′比较，前者无统计学差异（P＞0.05），而后者具有统计学意义（P＜0.05）。（3）SPIO浓度为12.6μg/ml和iRGD肽1μg/ml时，显微镜下观察，细胞均呈“菱形”及“类椭圆形”，经普鲁士蓝染色可见点状、小颗粒状及小片状蓝染颗粒，多位于细胞质内，少数位于细胞核，细胞标记阳性率约为82.9%。；原子吸收光谱检测结果示每个细胞内含铁量约为13.2pg；而SPIO同SPIO浓度系列下的SPIO对照组细胞阳性标记率为59.9%，每个细胞内含铁量为0.94pg。（4）适宜浓度的SPIO及iRGD肽组在T2WI-FRFSE序列上的平均信号变化率分别为21.07%、22.81%、23.09%、24.66%、24.2%；在T2-W PROPELLER图像上的平均信号变化率分别为20.91%、20.8%、22.79%、21.93%、21.26%，前者的平均信号变化率较后者好。（5）SPIO浓度为8.4μg/ml, 12.6μg/ml, 14.7μg/ml,16.

Results RLX(1 000 nmol/L), in combination with Ab25-35 (30 mmol/L), increased the cell viability (P
目的:研究中药单体柚皮苷(NG)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化过程中MAPK信号通路的影响。方法:观察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制剂SB203580、PD98059、SP600125及3种抑制剂全部加入的情况下,各组碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原(Col 什么 I)等骨向分化指标的差异。用Western blotting技术检测各组p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平,用荧光定量PCR技术检测细胞因子转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形成蛋白2(BMP-2)和核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA的表达。结果:(1)10-7mol/L为本实验中NG的最佳促骨向分化浓度。(2)NG最佳浓度组的ALP和BGP含量比其它各组都高(P0.05);与NG组相比,加入不同抑制剂组的ALP、BGP和ColⅠ表达量出现不同程度的降低。(3)与空白组相比,NG组JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05),p38蛋白的磷酸化水平降低(P0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4)NG组上调BMP-2的表达(P<0.05),下调Cbfα1的表达(P0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的TGF-β1、BMP-2和Cbfα1

mRNA表达量出现不同程度的降低。结论:NG主要通过激活MAPK信号通路中ERK通路、JNK通路以及上调BMP-2的表达,促进MSCs的骨向分化。NG上调BMP-2的表达受MAPK通路中p38通路的影响较大。
目的研究水通道蛋白9(AQP9)mRNA表达水平、水通道蛋白9及p38蛋白表达及其磷酸化水平对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02砷摄入的影响,探讨水通道蛋白9磷酸化的调控机制。方法采用电感藕合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内砷含量。采用实时定量PCR、免疫印迹法和免疫共沉淀技术分别检测不同处理后两细胞株中水通道蛋白9 selleck化学药品液面控制 mRNA、水通道蛋白9和p38蛋白表达水平及其磷酸化水平。采用SPSS统计软件分析实验数据。结果 HepG2细胞内砷含量及摄入速度高于L-02细胞。HepG2细胞的水通道蛋白9 mRNA表达水平在6 h内随NaAsO2处理时间延长而显著增加(P<0.05)。免疫沉淀实验结果显示,HepG2细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化水平随NaAsO2处理时间和浓度的增加而增加,而L-02细胞在各时间和浓度处理点水通道蛋白9蛋白磷酸化水平与对照相比明显增加,但处理间无明显差异;p38的磷酸化水平在两种细胞中均随砷处理时间延长而增加;SB203580抑制p38活性后能完全取消L-02细胞水通道蛋白9蛋白的磷酸化,而对HepG2细胞水通道蛋白9蛋白磷酸化无明显影响。结论水通道蛋白9的表达及磷酸化水平可能在调节细胞砷摄入中发挥重要作用,在不同细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化的调控机制有所差异。
AIM:

To investigate the mechanism of interleukin (IL)-6 secretion through blocking the IL-17A/IL-17A recepto (IL-17RA) signaling pathway with a short hairpin RNA (shRNA) in hepatic stellate cells (HSCs) in vitro . METHODS: HSCs were derived from the livers of adul male Sprague-Dawley rats. IL-6 expression was evalu ated using real-time quantitative polymerase

而且 chain reaction and enzyme linked immunosorbent assay. The phosphorylation activity of p38 mitogen activated pro tein kinases (MAPK) and extracellular regulated pro tein kinases (ERK) 1/2 upon induction by IL-17A and suppression by IL-17RA shRNA were examined using Western blotting.RESULTS: IL-6 expression induced by IL-17A was significantly increased compared to control in HSCs (P < 0.01 in a dose-dependent manner). Suppression of IL17RA using lentiviral-mediated shRNA inhibited IL-6 expression induced by IL-17A compared to group with only IL-17A treatment (1.44 ± 0.17 vs 4.07 ± 0.43, P < 0.01). IL-17A induced rapid phosphorylation of p38 MAPK and ERK1/2 after 5 min exposure, and showed the strongest levels of phosphorylation of p38 MAPK and ERK1/2 at 15 min in IL-17A-treated HSCs. IL-6 mRNA expression induced by IL-17A (100 ng/mL) for 3 h exposure was inhibited by preincubation with specific inhibitors of p38 MAPK (SB-203580) and ERK1/2 (PD-98059) compared to groups without inhibitors preincubation (1.67 ± 0.24, 2.01 ± 0.10 vs 4.08 ± 0.59, P < 0.01). Moreover, lentiviral-mediated IL-17RA shRNA 1 inhibited IL-17A-induced IL-6 mRNA expression compared to random shRNA in HSCs (1.44 ± 0.17 vs 3.98 ± 0.

明确GSK-3β抑制剂TDZD-8治疗能否抑制MI/R中炎性因子的产生,减轻MI/R病理损伤过程中的炎症反应,从而发挥抗炎作用。 2.如果是,进一步探讨GSK-3β抑制剂TDZD-8作用的具体信号转导机制,尤其是p38MAPK和NF-κB分子在其中的作用。

3.确定GSK-3β抑制剂TDZD-8能否下调再灌注激活的TLR2/NF-κB信号通路活性。 4.研究GSK-3β抑制剂的上述抗炎和抑制免疫效应是否最终有助于减少I/R导致的细胞凋亡和心梗范围,从而发挥显著的心脏保护作用。 实验方法 1.雄性SD大鼠,腹腔麻醉后,开胸选择性结扎冠状动脉左室支,制备心肌I/R大鼠模型。分离股动脉并插管记录动脉压,分离颈静脉建立静脉通路。缺血30 min,再灌注6 h,再灌注开始后封闭胸腔,恢复动物自主呼吸。再灌注前5min颈静脉推注不同浓度TDZD-8(0.1,1mg/kg)。I/R术中通过八道生理记录仪持续记录大鼠心电图、心率、动脉压及左室内压等血流动力学指标;分别于缺血前、缺血30 min、再灌注2h、6 h由尾静脉取血,测血糖水平;再灌注6 h后由颈动脉取血2 ml,分光光度法检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。 2.动物模型的制作同第一部分。再灌注前5min分别静脉推注二甲基亚砜(DMSO)或TDZD-8(1mg/kg)。再灌注6h后采用DAPI细胞核标记和末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法(TUNEL)复染定性和定量检测心肌细胞凋亡指数(AI)。AI以TUNEL阳性细胞数占总细胞计数的百分比表示;采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围(IS),IS以心脏梗死范围(INF)占缺血区面积(AAR)的百分比表示(INF/AAR×100%);留取心肌组织,用ELISA试剂盒检测组织TNF-α和IL-6的含量;分光光度法检测心肌髓过氧化物酶(MPO)活性;再灌注30min后采用Western BGB324 花费 Blot方法测定缺血心肌组织NF-κBp65, p38MAPK,GSK-3βSer9磷酸化蛋白含量,以检测其活性。 3.动物模型的制作同第一部分,应用实时荧光定量(RT)-PCR观察再灌注不同时间点(1h-24h)TLR2mRNA;免疫组织化学检测再灌注12h后TLR2在心脏组织中定位情况。于再灌注前5min静脉推注TDZD-8(1mg/kg),观察再灌注1h后TLR2mRNA和下游炎症因子TNF-α和IL-6mRNA变化及两者相关性;Western

Dabrafenib研究购买 Blot方法测定缺血心肌组织NF-κBp65磷酸化蛋白含量及与TLR2mRNA相关性;采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围(IS)。 实验结果 1.各组间心率在缺血期和再灌注期均不存在显著性差异,各组动脉压在缺血期间较假手术组下降(P<0.05)。CK和LDH活性反映心肌损伤程度。二者在大剂量TDZD-8组显著降低(P<0.05),增加GSK-3βSer9磷酸化(P
研究背景 WHO《世界卫生统计2008》报告:在未来的二十年,随着中低收入国家人群进入老龄化,非传染性疾病的死亡率将会大幅度增长。从全球范围看,预计到2030年,死于心血管疾病的人数将从2004年的1710万增加到2340万。 冠心病( coronary heart disease, CHD )是人类死亡的主要原因之一,每年有约380万男性和340万女性死于冠心病。发生急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后,尽早进行有效的心肌再灌注,无论是使用溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗( percutaneous coronary intervention, PCI ),还是急诊冠脉搭桥( coronary artery bypass grafting, CABG )治疗都是最有效的减小心肌梗死面积和改善临床预后的策略。然而,缺血心肌恢复血流灌注的过程中,可以诱导损伤,这种现象,称为心肌缺血再灌注损伤,可以减少心肌再灌注产生的有利影响。这种形式的损伤,可以使那些在再灌注前即刻仍然存活的心肌细胞在再灌注后很快死亡。这种形式的心肌损伤本身可以诱导心肌细胞死亡和增加心肌梗死面积,或许可以部分解释为什么尽管给予最适的心肌再灌注治疗,AMI后死亡率仍然接近10%,AMI后心力衰竭的发病率仍然接近25%。A

Cobimetinib购买 MI动物模型研究表明,最终的梗死面积,其中50%是致命的再灌注损伤引起的;这些实验模型中,许多治疗方法都显示出能够改善致命的再灌注损伤。然而,将这些能够改善再灌注损伤的实验方法运用到临床的时候,结果却令人非常失望。虽然如此,但是在2003年,赵志青教授等报告在体犬心局部缺血45 min后,再灌注开始早期给予三个循环的30 s心肌缺血/30 s心肌再灌注,可明显减小犬心肌梗死面积。并将这种心脏保护作用命名为缺血后处理( ischemic postconditioning IPost )。之后不久,Staat和Laskey分别在临床上进行PCI的AMI患者身上进行IPost,结果发现IPost能够减小心肌梗死面积达36%以及促进心肌再灌注。 虽然IPost诱导产生心脏保护作用的确切机制仍然没有完全清楚,但是发现可能是通过减轻氧化应激反应,减少细胞内Ca2 +超载,改善血管内皮功能,减少凋亡心肌细胞的死亡,减少中性粒细胞积累以及延迟中性pH的恢复。此外,发现IPost激活再灌注损伤补救激酶( reperfusion injury salvage kinase, RISK )途径,包括磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol-3-kinase, PI3-K )-蛋白激酶B ( Akt )途径和细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulating kinases, ERK )途径。最近,一些研究发现糖原合酶激酶-3β( glycogen synthase kinase-3beta, GSK-3β) Ser9磷酸化能促进心肌对缺血再灌注损伤的耐受。 IPost保护心肌缺血再灌注损伤的大多数研究都是在成年鼠类离体心脏上进行的,并发现心脏保护信号及促细胞生存机制可能涉及PI3-K/Akt, ERK1/2以及GSK-3β等。最近有一些研究发现IPost未能保护老年小鼠心脏。但是关于IPost的保护作用能否在老年大鼠或人身上获得及相关机制还是知之甚少。 研究目的 (1)确定成年大鼠在体心脏急性缺血后再灌注即刻给予缺血后处理能否保护心脏,减轻缺血再灌注损伤。 (2)评价缺血后处理能否减轻老年大鼠在体心脏缺血再灌注后的损伤,并比较后处理保护作用在成年大鼠与老年大鼠之间的区别。 (3)初步确定老年大鼠缺血后处理的保护作用是否与心肌细胞内PI3-K/Akt及GSK-3β的磷酸化有关,如果有关,则激活PI3-K/Akt和GSK-3β可能是治疗缺血再灌注损伤的新的治疗手段。 实验方法 1.

38±145.24)、血清MDA水平(66.04±13.67 vs 0.77±0.23)明显高于无并发症组(P＜0.05)。 3.各组HO-1表达的比较:正常对照组的外周血单核细胞HO-1mRNA(0.44±0.26)和蛋白(16.37±15.01)表达水平均低于两个糖尿病组(P＜0.01),而并发症组HO-1mRNA(1.02±0.27 vs 0.77±0.23)及其蛋白(85.74±10.89 vs61.45±21.81)表达水平均显著高于无并发症组(P＜0.05)。 4.相关分析显示,HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA(r=0.750,P=0.000)、ROS(r=0.608,P=0.000)、MDA(r=0.623,P=0.000)呈显著正相关。HO-1mRNA与MDA(r=0.449,P=0.010)、FPG(r=0.364,P=0.041)及2hPG(r=0.477,P=0.016)呈显著正相关。MDA与ROS呈显著正相关(r=0.788,P=0.000)。 5.偏相关分析显示,在控制BMI、FPG、2hPG、HbAlc影响因素后,HO-1蛋白表达仍与ROS产量(r=0.567,P=0.027)、MDA(r=0.613,P=0.015)呈显著正相关,MDA与ROS产量呈显著正相关(r=0.911,P=0.000)。 一般 【结论】 1.初诊T2DM患者的血糖、血清MDA、外周血单核细胞ROS产量及HO-1表达均显著高于正常对照组,提示初诊T2DM可能由于机体抗氧化防御机制的代偿性增高仍不足以对抗高血糖引起的氧化损伤,导致机体处于氧化应激状态。 2.并发症组的血糖水平、氧化应激指标及HO-1表达均显著高于无并发症组,提示高血糖及其引起的氧化损伤可能参与了初诊T2DM患者慢性并发症的发病机制,在排除BMI及血糖水平等因素的影响后,氧化应激指标仍与HO-1表达呈显著正相关,提示HO-1作为一种应激反应蛋白,在糖尿病所致氧化应激情况下代偿性表达增高,但仍不足以对抗该氧化应激。提示除严格控制血糖外,通过适当的手段诱导HO-1高表达将是极具潜力的糖尿病慢性并发症防治的新靶点之一。
研究背景

动脉粥样硬化是慢性炎症性疾病。高脂血症时,血浆低密度脂蛋白(LDL)进入动脉壁氧化成为氧化低密度脂蛋白(oxLDL),被巨噬细胞吞噬后转化为泡沫细胞,发生动脉粥样硬化。既往研究证实,天然属性IgM亚类抗体通过封闭oxLDL与巨噬细胞结合的表位,抑制巨噬细胞对oxLDL的吞噬,从而降低泡沫细胞与动脉粥样硬化斑块的形成。临床研究发现血清高浓度脂多糖/LPS与动脉粥样硬化发病密切相关,但机理尚不十分明确。

目前还没有关于高脂饮食饲养的正常小鼠是否能够诱导产生天然属性抗氧化低密度脂蛋白IgM亚类抗体,从而能影响动脉粥样硬化发生发展;体内或者体外应用这些天然抗体是否有保护作用;以及在LPS血清浓度升高提高动脉粥样硬化的发病过程中,这些天然抗体是否参与尚未见报道。基于以上,我们设计并完成了相关实验。 ERK pathway inhibitors 目的: 1.制备并鉴定天然属性的抗LDL及抗oxLDL IgM亚类抗体,为研究LDL和oxLDL及其天然抗体在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定基础。 2.探讨天然属性的抗oxLDL IgM亚类抗体对巨噬细胞与oxLDL结合的影响,了解其在动脉粥样硬化发病机制中的作用。 3.以apoE基因敲除小鼠为研究对象,复制动脉粥样硬化模型,研究天然属性抗oxLDL IgM亚类抗体对apoE基因敲除小鼠血脂、血oxLDL和主动脉粥样硬化斑块形成的影响。 4.探讨脂多糖活化对巨噬细胞与oxLDL结合的影响,了解脂多糖活化对天然IgM亚类抗体在动脉粥样硬化中的保护作用的破坏机理,进一步了解天然抗体在动脉粥样硬化中的作用。 方法: 1.给予饲养在无特殊病原体条件下Babl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选。鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类、亚型,进而采用免疫印迹、免疫沉淀法和ELISA法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定。 2.体外培养小鼠巨噬细胞系;纯化IgM抗体3A6并将其与Na125I标记的oxLDL作用形成免疫复合物。通过油红O染色及细胞结合同位素标记oxLDL,以观察3A6对巨噬细胞对oxLDL吞噬的封闭作用。 以及 3. 18只8周龄apoE基因敲除小鼠随机分为对照组(腹腔注射PBS/2ml/周);5G8组:(腹腔注射天然属性抗低密度脂蛋白IgM亚类抗体5G8/10μg/g体重,2ml/周)和3A6组(腹腔注射天然属性抗氧化低密度脂蛋白IgM抗体3A6/10μg/g体重,2ml/周)。高脂饲料饲养16周后行处死,分离血清,测定血清脂质含量及血浆oxLDL含量,小鼠原位灌注固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色,对各个切面的动脉粥样斑块面积进行分析。

4. LPS刺激巨噬细胞后,通过油红O染色及细胞结合同位素标记oxLDL,观察IgM抗体3A6在LPS活化巨噬细胞情况下对oxLDL吞噬地影响。分别利用TLR4的中和性单抗, p38MAPK阻抑剂SB203580和NF-κB阻抑剂PDTC作用及Fcα/μ受体进行RNA干扰后,利用实时定量RT-PCR和流式细胞术观察Fcα/μ受体mRNA转录及蛋白表达情况。 结果: 1.杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来,可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化,最终获得2株稳定分泌天然属性抗LDL抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定分泌天然属性抗oxLDL抗体,命名为3A6,3株抗体均属于IgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀、ELISA等实验要求。 2.天然属性抗oxLDL IgM亚类抗体3A6,在体外试验中能够抑制巨噬细胞与铜氧化的LDL的结合,从而降低泡沫细胞的形成。 3. apoE基因敲除小鼠高脂饲料喂养16周后,三组之间的各项血脂及oxLDL含量无明显差异;HE染色结果显示:三组均出现动脉粥样硬化斑块,但3A6组可显著降低胸主动脉斑块面积和校正面积,与对照组和5G8组比较差异有显著性。 4. 3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬细胞对铜氧化的LDL的结合,并且促进铜氧化的LDL介导的泡沫细胞的生成。我们分别利用3A6 F(ab′)2、Fcα/μ受体RNA干扰或者利用不识别oxLDL的IgM抑制了oxLDL-IgM与脂多糖活化的巨噬细胞的结合,意味着Fcα/μ受体对这个过程是起作用的。同时,脂多糖促进Fcα/μ受体的表达有时间和剂量的依赖性,TLR4特异性中和抗体的封闭作用可减少LPS的作用。另外,脂多糖诱导的p38MAPK磷酸化和NF-κB 65的转位促进了Fcα/μ受体表达的上调。当使用p38MAPK阻抑剂SB203580和NF-κB阻抑剂PDTC,可降低了Fcα/μ受体表达的上调。 结论: 1.抗LDL及抗oxLDL IgM亚类单抗的制备为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具。 2.

96孔板上体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用MTT法确定细胞的增殖状态。 2.体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用不同终浓度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。

selleck 3.在96孔板上体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用CCK-8法确定细胞的增殖状态。 4.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用不同终浓度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。 研究结果 1.采用MTT法确定人脐静脉血管内皮细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.909±0.012, CLZ10μmo/L组0.904±0.026; CLZ30μmol/L组0.851±0.023; CLZ100μmol/L组0.670±0.013; CLZ300μmol/L组0.651±0.036。统计分析显示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分别能明显抑制HUVECs的增殖(P0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(86.7±1.6,77.9±2.3,P
口腔癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一,近年来口腔癌的发病率呈现明显增高趋势、且发病低龄化,已成为威胁人类健康的重要疾病之一。口腔癌的首选治疗方法是外科手术治疗,而化学治疗是口腔癌重要的辅助治疗方法之一。目前化疗所面临的主要问题是肿瘤细胞对化疗药物敏感性的下降,导致多药耐药(Multidrug

resistant, MDR)的产生,使肿瘤细胞产生具有同时抵抗具有不同结构和功能作用的广谱化疗药物的能力。目前认为,肿瘤细胞这种多药耐药的形成,与包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在内的膜泵出蛋白的过度表达密切相关。 P-gp是源于ATP-结合盒家族(ATP-binding Cassette superfamily,ABC)的种跨膜磷酸糖蛋白,由MDR-1基因编码。P-gp是一种具有ATP酶活性的跨膜泵,其作用底物可以是内源性的物质(如细胞因子、类固醇激素等),也可以是外源性的物质(如化疗药物等)。P-gp具有将大量化合物,尤其是水合阳离子的化合物从细胞内泵至细胞外间隙的功能,从而导致细胞内P-gp作用底物浓度的降低。当抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞时,脂溶性药物通过浓度梯度而进入细胞内,药物在细胞内与P-gp结合后,P-gp通过水解ATP获得能量将细胞内药物泵出细胞外,从而导致细胞内药物的浓度不断下降,使药物对细胞的损害减弱并直至消失,最终产生耐药性。不同组织细胞中P-gp的作用不同,如在肠道主要影响药物的吸收,在肝脏和肾脏则主要影响药物的代谢与排除,在中枢神经系统和循环系统则主要影响药物的分布,其可降低细胞内的药物浓度从而使机体免受药物的损害。在人恶性肿瘤的研究发现,P-gp的表达水平与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性及肿瘤患者的生存率呈负相关。有研究认为,不同的个体MDR-1基因是有差异的,但在治疗前MDR-1基因多态性表现并未影响细胞内药物的转运和患者病情的发展。当肿瘤细胞与抗肿瘤药物长期接触后,诱导MDR-1基因扩增并且大量表达P-gp。 所以 环氧化酶(Cycloxygenase, 查找更多 COX)是花生四烯酸转化为前列腺素(Prosta-glandin, PG)过程中的限速酶,直接影响PG的合成并参与机体的许多生理和病理过程。目前已发现COX有2个亚型,即COX-1和COX-2。COX-1是一种在许多组织细胞内持续表达的“结构酶”,具有促进生理性前列腺素的合成,调节和维持组织细胞正常生理活动的作用。在保持自身稳定方面,具有重要的生理功能,如调节肾血流量、保护胃黏膜及血小板功能等。COX-2主要存在于中枢神经系统、精囊和肾脏等组织中,而在其他正常组织中检测不到,但当机体有不同的炎症反应和受到促有丝分裂刺激后,则会产生COX-2,催化合成PG而参与炎症反应。各种生长因子、致炎细胞因子、胆汁酸、致癌剂和紫外线光谱照射均可促进COX-2的表达。目前认为,包括口腔癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展与COX-2的过表达有关,其可导致上皮细胞癌变的发生,其影响的方面包括肿瘤发生、细胞外基质的黏附性增强、抗细胞凋亡作用、降低E-cadherin和TGF-p2受体的表达以及增强Bcl-2蛋白的表达等。

近年来研究发现,选择性COX-2抑制剂除可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡外,还能增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等,此外研究认为COX-2抑制剂可以通过调节ABC-转运家族中的膜转运蛋白活性而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。 在本研究中,我们通过体外实验研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用及对P-gp表达和功能调节的影响,初步探讨选择性COX-2抑制剂增强KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的作用机制。 第一章塞来昔布增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用 目的：研究COX-2抑制剂塞来昔布与长春新碱联合应用后能否增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用。方法：收集对数生长期KB和KB/VCR细胞,以2×103个/孔浓度分别接种于96孔板,常规培养24h,细胞贴壁后将含长春新碱的培养基,浓度分别为0.375、0.75、1.

大多数非小细胞肺癌患者确诊时已是晚期,已铂类为基础的一线联合化疗是晚期非小细胞肺癌患者的标准方案,但是,其疗效并不明确。 精确的诊断和分期对于肺癌患者尤为重要。18F-FDG PET/CT将PET与CT完美融为一体,用于诊断各种肿瘤。PET与CT的结合不仅强化了各自的优势,还最大程度的降低了各自的局限性。对于大多数的肿瘤,PET/CT是诊断和分期不可多得的有效工具。由PET提供病灶详尽的功能与代谢等分子信息,而CT提供病灶的精确解剖定位,一次显像可获得全身各方位的断层图像,具有灵敏、准确、特异及定位精确等特点,可一目了然的了解全身整体状况,达到早期发现病灶和诊断疾病的目的,除此之外,还可以提供疗效信息,早期知晓药物的疗效,以便医生及早更换治疗方案。PET-CT的出现是医学影像学的又一次革命,受到了医学界的公认和广泛关注,堪称“现代医学高科技之冠”。越来越多的临床专家以及患者认可PET-CT。

Baf-A1价格 目前,PET/CT的作用在于：肿瘤的诊断和分期,利用肿瘤细胞“捕获”FDG的能力增高的特点,不仅可以早期发现和确定恶性肿瘤原发灶的部位、大小,还可评估肿瘤的恶性程度；监测肿瘤复发和转移；早期疗效评估,主要是根据肿瘤组织对18F-FDG的摄取变化,通过可视或定量分析,在临床或亚临床水平早期预测疗效,是治疗后评估肿瘤代谢、决定残存肿瘤状况的非侵入性诊断方法；指导活检部位,能显示肿瘤代谢最活跃的部位,尤其是对肺部多个病灶的患者,它可指导活检定位在肺部肿物的最高活性区,避免活检穿刺时样本取自坏死中心、纤维组织或邻近组织,降低假阴性结果；寻找转移性肿瘤的原发病灶,原发灶不明转移性肿瘤(cancer with unknown

primary CUP)临床并不少见,约占所有癌症患者的10%。CUP中原发灶未能发现的原因可能为：①原发肿瘤由于免疫因素或血管机制被破坏；②由于特异性基因发生改变,只促使转移发生而不促进局部原发灶生长,所以不能形成临床所能发现的原发灶；③原发肿瘤自动消退；④检查器械和检查手段的限制,难以发现小的原发灶；⑤医生的临床经验不足导致漏诊；⑥有些患者原发灶未发现时就已死于其他疾病。因此,明确原发灶是对恶性肿瘤恶性行为的预测及制定合适治疗方案的基础。PET反映的是病变的生化、代谢方面的改变,由于疾病的发生发展过程中,生化、代谢异常早于其形态结构的改变,因此PET显像对肿瘤的功能、代谢变化等的检测具有独特的作用。 近几年,有些研究发现不管早期患者还是晚期患者,原发病灶的SUV值高,提示治疗疗效欠佳、预后差,因为原发病灶SUV作为一个摄取氟代脱氧葡萄糖半定量的检测指标,其与肿瘤细胞增殖和侵袭性有关。但是并不是所有的研究都控制了肿瘤大小和分期,所以仍说明SUV检测值是预后和疗效评估的独立预测因子。 2012年Brendon M等[11]发表了一篇530例早期非小细胞肺癌手术患者的回顾性研究,中位随访时间为19个月。他对SUVmax与原发病灶直径分四等分,并进行相关性研究。发现肿瘤越大,SUVmax越大(OR,2.04; 点击此处 CI,1.68-2.47;p
蛋白酪氨酸激酶（PTK）与肿瘤信号传导关系密切，已被成功作为抗肿瘤药物的靶点。其中，肝细胞生长因子（HGF）受体（c-Met）在多种肿瘤细胞中高表达，对促进细胞生长、降低细胞凋亡、改变细胞骨架功能、增加转移和其它生物学改变起关键作用。因此，靶向于HGF/c-Met通路是防治c-Met高表达肿瘤的新策略。 固相合成自问世以来，已经由最初的肽合成扩展到各类有机小分子及复杂的天然产物的合成，固相合成需要固相载体及连接固相和反应物的连接分子，正确选择载体和连接分子决定着固相合成的成功。玻璃是一种价廉易得的材料，只需将其加工成特定粒度，表面加以修饰即可作为固相载体而应用。

Quisinostat 本文主要开展了两方面的研究工作：一是根据酪氨酸激酶抑制剂的构效关系规律，设计合成以2-吲哚酮为母核的系列化合物，并对其进行初步的c-Met激酶抑制活性筛选；二是以玻璃珠为基质制备出固相载体，进而设计出将其应用于中间体固相制备的方案，以期为今后此类化合物的固相组合合成奠定基础。 主要研究工作及结果包括以下几个方面： 1.基于文献及本课题组前期研究总结的c-Met激酶抑制剂构效关系规律，以L029和SU11274为先导化合物，设计并合成了21个以2-吲哚酮为母核的新化合物。其中，在2-吲哚酮母核的3位以双键桥接香兰素和异香兰素及其衍生物，制备出化合物T1-T18，该类化合物保留了先导化合物的共轭双键。在化合物L029的N-1位引入3-N,N-二甲基丙基制得化合物T19，其具有较好的化学稳定性。在5-氟-2-吲哚酮母核的3位以双键桥接异香兰素的衍生物。所有目标化合物均经过核磁共振氢谱和质谱进行了结构确证。 2.对合成的21个化合物进行初步的活性评价。在c-Met激酶抑制活性筛选中，大多数目标化合物均有抑制活性，其中化合物T15抑制活性明显高于阳性药物L029，1μM浓度下抑制率为30.3%。初步构效关系分析表明对制备2-吲哚酮类c-Met激酶抑制剂而言，在其3位双键连接香兰素衍生物可使其抑制活性显著增强，在其5位引入磺酰胺基团及氟原子对其抑制活性有利。在MCF-7细胞增殖活性实验中，化合物T19的GI50值2.85μM，其活性明显高于阳性化合物SU11274，后者的GI50值为10.85μM。 3.以玻璃珠为基质，经羟基化修饰后完成表面硅烷氨基化，定量测得氨基含量为0.

4%和39.6%,而在shRNA-STAT1转染的细胞中,Bortezomib诱导的CD14和CD11b仅为10.1%和19.6%。给与PD98059或SP600125抑制Bortezomib引起的HL60细胞分化的同时,观察到STAT1水平上调被抑制,活性水平被抑制,C/EBPa表达也受到抑制。上述结果表明Bortezomib激活的MEK/ERK-JNK通路可能通过进一步激活分化相关转录因子STAT1诱导AML细胞的分化。 3) Bortezomib诱导的AML细胞分化与凋亡为RARα非依赖的过程。 Western blotting结果显示,Bortezomib作用于HL60后,维甲酸受体RARa蛋白水平增加,但通过双荧光素酶检测系统检测结果显示,RARa转录活性无显著变化。同时流式细胞术检测结果表明Bortezomib能诱导RARa突变的HL60R细胞分化抗原CD11b的表达及凋亡的发生。以上结果提示Bortezomib诱导AML细胞的分化与凋亡是RARα非依赖的过程。

获悉更多 4) Bortezomib诱导AML细胞分化的同时,伴随着AML细胞的凋亡,并初步探讨Bortezomib引起的AML细胞分化与凋亡之间的关系。 Annexin V/PI双染流式细胞术检测结果显示,5 nM Bortezomib在诱导白血病细胞分化的同时,伴随了时间依赖性的细胞凋亡。但由MEK/ERK-JNK通路的抑制引起的Bortezomib细胞分化的抑制过程中,Bortezomib引起的细胞凋亡率无显著性变化。由此推测,Bortezomib诱导的AML细胞的分化与凋亡可能是两个相对独立的过程。 第二部分：Bortezomib通过抑制ATRA引起的RARa蛋白的降解,协同ATRA诱导AML细胞粒性分化。 VE-821分子量 1) Bortezomib协同ATRA诱导AML细胞粒性分化。 MTT检测法显示Bortezomib与ATRA联合作用能协同抑制HL60与NB4细胞的增殖。通过台盼蓝拒染法与血细胞计数板法,计数并绘制Bortezomib与ATRA联合作用后的细胞的增殖曲线和存活率曲线。结果显示Bortezomib(在HL60细胞上选用浓度2.5 nM,在NB4细胞上选用浓度2.5、5 nM)单药作用不影响细胞的存活率和细胞增殖能力,但能显著增强ATRA引起的细胞增殖抑制作用,而这种作用并不是通过诱导细胞死亡实现的。我们从形态学、生化指标及分子标志三方面指标证实了Bortezomib能促进ATRA诱导的HL60、NB4细胞的分化,具体表现为与ATRA单用组相比,药物联用组引起的核分叶比例显著增加,NBT还原能力显著增强,分化抗原CDllb表达量显著增加。

在人原代白血病细胞上,ATRA与Bortezomib也具有协同作用。在M3-AML型、AML/ALL混合型、AML-resistance型三个原代病人骨髓中分离得到原代白血病。通过细胞计数或CCK8检测,结果显示两药联合作用后细胞存活率显著低于单用组。在M3-AML型原代病人样本上,Bortezomib增强了ATRA引起的细胞NBT还原能力。 2) Bortezomib联合ATRA通过诱导HL60细胞分化,抑制裸小鼠HL60移植瘤的生长。 裸小鼠HL60人白血病细胞移植瘤实验结果显示,ATRA (5 mg/kg)组及Bortezomib (0.1 mg/kg)组均表现出一定的抗肿瘤作用,其T/C%值分别为58.0%和62.0%,抑瘤率分别为40.0%和20.0%,联合作用组T/C%值和抑瘤率分别为45%和58.9%,说明Bortezomib与ATRA在体内也有较好抗肿瘤协同作用。通过分离得到瘤组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测,显示联用组瘤组织中分化抗原CD11b的表达率为53.1%,显著高于ATRA单用组(40.4%)和Bortezomib单用组(38.6%)。从免疫组化结果也得出类似的结果,在联用组中C/EBPε的表达量明显高于对照组与单药组。此外,采用TUNEL染色检测了瘤组织中的凋亡情况,显示该剂量配比下,瘤组织中几乎检测不到凋亡的发生。

购买Doxorubicin 3) Bortezomib协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究 20S蛋白酶体活性检测结果表明,蛋白酶体活性在ATRA诱导的HL60和NB4细胞分化过程中明显上调,Bortezomib显著抑制了这一上调现象。与之对应的,在ATRA诱导的HL60和NB4细胞分化过程中RARα蛋白经泛素蛋白酶体通路介导呈下调趋势,Bortezomib与ATRA联合作用后,RARα蛋白得以累积,而其mRNA水平无显著性变化。RARα与维甲酸反应元件RARE结合能直接介导转录因子STAT1的表达。ATRA能诱导STAT1的表达,Bortezomib与ATRA联合作用后,STAT1 mRNA水平显著增加。以上结果提示了Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,增强了RARα转录活性。Western blotting检测瘤组织中RARα蛋白的表达含量,结果显示Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,联用组中RARα蛋白含量显著高于ATRA单用组。 Western blotting结果显示ATRA上调了STAT1蛋白水平和Tyr701位点磷酸化水平,Bortezomib与ATRA联合作用进一步上调STAT1的蛋白水平和活性,而该浓度Bortezomib单独作用对其无显著影响。免疫荧光结果显示合用组细胞核中STAT1的分布显著增加,EMSA检测结果进一步证实提示了STAT1与DNA结合能力显著增加。慢病毒介导的shRNA-STAT1显著下调了HL60细胞中的STAT1蛋白水平,同时部分逆转了Bortezomib对ATRA诱导的细胞分化的协同作用。以上结果显示STAT1参与了Bortezomib协同ATRA诱导细胞分化的过程。 免疫荧光结果显示,p65在ATRA单用组、与Bortezomib联用组细胞中的分布无显著性差异。此外,ATRA或Bortezomib单用组中MEK活性增强,但联用组与单用组MEK活性无显著性差别。JNK通路活性在ATRA与Bortezomib联合诱导细胞分化过程中变化不大。以上结果显示了NFκB通路与MEK.

05),在冠状血管ADM阳性表达面积和平均光密度明显明显低于3dEP组和C组(p<0.05)。(7)3dEP组心肌ADM含量与C组相比,差异不具有显著性;3wEP组心肌ADM含量明显高于C组(p
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿瘤。资料表明,目前我国乳腺癌发病率正以每年2%-3%的速度递增,10年间我国主要城市的乳腺癌发病率增长了37%。特别是在30-54岁年龄组中,乳腺癌已成为威胁女性健康的“头号杀手”。受体三阴性乳腺癌(triple-negative

www.selleckchem.cn/products/MLN8237.html breast cancer, TNBC)是近些年学者提出的一个新的乳腺癌亚型,是指肿瘤细胞膜表面缺乏雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的一类乳腺癌。TNBC的发病率占乳腺癌总发病率的11%-20%,尤其好发于年轻女性,且该类乳腺癌具有术后易复发、易远处转移和预后差的特点,对内分泌治疗和针对HER-2的靶向治疗无效,至今仍缺乏令人满意的综合治疗方案。 近年来,非甾体类抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)在抑制肿瘤活性方面展示了很好的应用前景,大量体内外研究显示,常规服用NSAIDs可以大幅度降低乳腺癌等多种肿瘤的发病风险,因此,该类药物引起了广大学者的关注。Harris等研究发现,新一代特异性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂celecoxib,不仅能明显延迟肿瘤的发生,还可以降低乳腺癌的发病率及肿瘤体积。目前,有学者研究认为,celecoxib的抗肿瘤作用机制可能与降低肿瘤组织COX-2表达、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡有关。但也有学者认为celecoxib的抗肿瘤作用机制并不是依赖抑制COX-2途径,其具体作用机制目前尚存在争议。 Kim和Subhashini等研究报道,celecoxib可通过NF-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)途径抑制宫颈癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡。而NF-κB活性失控与肿瘤的形成密切相关,且TNBC中NF-κB异常活化,因此我们想阐明在TNBC中celecoxib是否主要通过下调异常活化的NF-κB而发挥作用。 NF-κB是1986年发现的,从成熟的B淋巴细胞中抽提出的能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的核因子。抑制NF-κB活性可以抑制肿瘤细胞增长、促进细胞凋亡、增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、抑制炎症反应、减少肿瘤血管生成等。作为NF-κB主要发挥转录调节功能的亚基p65,在肿瘤的发生、发展中发挥着关键性作用,下调p65的表达可以抑制多种肿瘤细胞在体内外的增殖及诱导细胞凋亡。因此,p65的靶向治疗可能在乳腺癌的临床治疗中拥有广泛的应用前景。 Protein Tyrosine激酶抑制剂 目的:本实验中选取三阴性高侵袭性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为研究对象,通过不同的实验方法探讨celecoxib的抑癌作用,研究celecoxib在三阴性乳腺癌细胞中对NF-κB活性的影响;检测异常活化的NF-κB信号通路在MDA-MB-231细胞增殖、凋亡以及侵袭中发挥的作用;评价celecoxib是否能够成为TNBC个体化治疗的辅助用药,针对NF-κB信号通路的靶向治疗能否使乳腺癌的化学治疗更加完善,最终为预防、治疗TNBC提供新的治疗思路。

方法: 1以不同浓度的celecoxib作用人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,MTT比色法观察其对该细胞增殖的影响,并进一步探讨celecoxib抑制MDA-MB-231细胞的增殖与COX-2途径依赖关系。采用流式细胞仪技术(flow cytometry, FCM)、Hoechst 33258、DNA Ladder形成实验、western blot等方法,研究celecoxib对体外培养的MDA-MB-231细胞凋亡的影响。 2采用伤口愈合实验、transwell侵袭小室实验等,观察celecoxib对MDA-MB-231细胞侵袭行为的影响。并通过RT-PCR法检测肿瘤细胞侵袭转移关键的细胞因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)及IL-8(interleukin-8, IL-8)的表达变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-8的分泌水平。 3为了研究celecoxib的抗凋亡、抑制细胞侵袭作用与NF-κB信号通路的关系,应用western blot方法检测了不同浓度celecoxib作用后MDA-MB-231细胞的p65、p50、IκBα(inhibitory kappaBα,IκBα)以及磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表达情况,并进一步通过western

blot法检测p65的核转位变化。采用凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic 和 mobility shift assay,EMSA)检测用药前后NF-κB DNA结合活性的改变。 4构建表达p65cDNA的真核表达载体,转染MDA-MB-231细胞,观察过表达p65基因对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,并通过与celecoxib联合作用,揭示celecoxib和NF-κB信号通路之间的联系。 5利用微小RNA(microRNA,miRNA)技术,构建表达p65miRNA的真核表达载体,沉默p65基因的表达,观察NF-κB信号通路阻断对人乳癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡以及侵袭的影响。 结果: 1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞生物学活性的影响 1.1 Celecoxib对MDA-MB-231细胞增殖的影响 MTT分析结果显示,经celecoxib作用24h、48h和72h后,与溶剂对照组相比,对MDA-MB-231细胞增殖有明显的抑制作用(P0.05)。提示celecoxib不是通过COX-2和PGE2途径来抑制细胞的增殖。 1.2 Celecoxib对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 Celecoxib可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡,使部分细胞出现形态不规则、细胞核固缩聚集、空泡样变性、核碎裂等凋亡的形态学变化。Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察,有些细胞核内可见到有浓染致密的荧光颗粒,细胞核呈碎块状、颜色发白。随着celecoxib浓度的增加,凋亡细胞的比例也在逐渐增加,不同浓度组之间有显著差异(P<0.05),裂解蛋白表达上调(P<0.05)。Celecoxib还可以抑制MDA-MB-231组成性自分泌IL-8(P0.05)。 2.